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关键词： 多囊肾病   分子诊断   二代测序   胚胎植入前遗传学诊断   MARSALA  

摘要： 目的:分析多囊肾病（polycystic kidney disease,PKD）家系的临床特征,查找家系致病基因变异,明确家系先证者及其他成员的分子诊断,并根据患者的生育需求,提供遗传咨询、产前诊断及胚胎植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis,PGD）服务,预防 PKD 患儿出生。方法:收集10例PKD家系患者的临床资料,采集先证者及核心家系成员的外周血,提取基因组DNA行二代测序（next generation sequencing,NGS）,对候选变异进行生物信息学分析,并对先证者行Sanger测序验证及家系成员变异分析。在明确致病基因变异的基础上,运用联合诊断单基因病和染色体病非整倍体高通量测序与连锁分析（mutated allele revealed by sequencing with aneuploidy and linkage analyses,MARSALA）策略,对其中5个家系进行PGD。结果:10个家系共发现8种PKD1变异,3种PKD2变异,2种PKHD1变异。其中PKD1基因 c.3416417delTG、c.102640265insTCGG、c.10762T>C 以及 PKD2 基因 c.2118+2T>C、c.602delG、c.1548G>C,查阅 HGMD 数据库、ClinVar数据库及国内外文献均未见报道。根据美国医学遗传学与基因组学学会（the American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG）遗传变异分类标准及指南,PKD1基因 c.3416417delTG、c.102640265insTCGG 及PKD2 基因c.2118+2T>C、c.602delG 被归类为可能致病（likelypathogenic,LP）,PKD1 基因c.10762T>C及PKD2基因c.1548G>C被归类为临床意义未明变异（variants of uncertain significance,VUSs）。后续5个选择PGD生育的家系共活检囊胚39枚,检测32枚,结果每个家系均获得了可移植胚胎,共18枚,分别行单胚胎移植后,5个家系中有4个家系成功妊娠,对产前羊水及新生儿外周血行突变位点验证及染色体核型分析,结果均与PGD结果一致。结论:本研究通过基因诊断明确了 10个PKD家系患者的发病原因,并首次报道了 3种PKD1和3种PKD2基因新变异,这些新变异的检出拓展了 PKD的基因突变谱。本研究还是国内首批、福建省首次成功将基于MARSALA策略的PGD治疗应用于PKD家系,这不仅拓展了我院乃至我省PGD的治疗病种,进一步推动了生殖遗传学科的发展,更重要的是为众多PKD家系提供了生育健康后代的有效方法。

关键词： 水稻   驱动蛋白   胚囊育性   OsKIN7L基因   分子遗传学  

摘要： 驱动蛋白是一类以微管为轨道，以ATP为动力的马达蛋白分子，可通过影响纺锤体形成、染色体运动等方式调控减数分裂和有丝分裂，同时还在信号传导、胞内物质运输和细胞器迁移等过程中发挥重要作用。目前已发现在水稻中的驱动蛋白至少有86个成员，而kinesin-7家族在水稻中至少有6个成员，至今为止该家族基因在调控水稻雌性生殖发育过程的研究鲜有报道。　　本室前期在新型四倍体水稻华多1号（H1）中鉴定到一个kinesin-7亚家族的驱动蛋白基因OsKIN7L，初步发现该基因在调控水稻育性中具有重要的作用。为此，本研究利用前期通过CRISPR-Cas9编辑技术获得的基因敲除突变体，包括H1突变体kin7l-t和二倍体日本晴水稻（Nip）突变体kin7l-d，同时以各自的亲本为对照，开展OsKIN7L调控不同倍性胚囊育性的细胞及分子遗传学研究。获得如下主要结果：　　1.不同倍性水稻kin7l突变体的农艺性状表现　　二倍体和新型四倍体水稻kin7l突变体结实率分别下降34.65%和28.60%，株高分别下降7.15cm和3.55cm，主穗长分别下降2.15cm和0.84cm，千粒重分别下降1.74g和1.10g，与各自亲本比较，均存在显著差异。　　2.不同倍性水稻kin7l突变体的花粉和胚囊育性及其发育过程细胞学观察　　二倍体水稻kin7l突变体平均花粉育性为85.98%，略低于亲本的89.64%，而四倍体水稻kin7l突变体平均花粉育性为91.93%，也略低于亲本的95.65%。另外，两者的花粉活力与对照也无明显差异。通过WE-CLSM技术观察，二倍体和四倍体水稻kin7l突变体胚囊育性分别为47.60%和66.49%，明显低于亲本的93.04%和90.86%。二倍体水稻kin7l突变体成熟胚囊以极核异常为主，异常率为21.04%，可见的异常现象主要出现在八核胚囊时期。新型四倍体水稻kin7l突变体则以胚囊退化为主，异常率为12.83%，可见异常最早出现在功能大孢子发育时期，比二倍体水稻突变体的早。***7L调控不同倍性水稻胚囊育性的分子遗传学研究　　（1）生信分析及表达模式　　OsKIN7L基因组共有5417个碱基，包含14个外显子和13个内含子，编码642个氨基酸，在N端具有一个保守的马达结构域，与kinesin-7亚家族的拟南芥AtNACK2蛋白在进化上最为接近。RT-qPCR研究表明，OsKIN7L在不同倍性水稻中均属于组成型表达，且在子房与花药中具有较高的表达量。GUS染色结果显示不同发育时期颖花均能染上色，与RT-qPCR结果基本吻合。亚细胞定位实验表明，OsKIN7L蛋白定位在细胞质中。　　（2）不同倍性水稻突变体胚囊发育期间子房基因表达谱分析。　　分别利用二倍体水稻kin7l突变体及其亲本四核胚囊时期子房和四倍体水稻kin7l突变体及其亲本减数分裂期子房开展转录组测序分析。二倍体水稻样品中，共检测到402个差异表达基因，其中表达上调基因195个，下调基因207个;四倍体水稻样品共检测到269个差异表达基因，表达上调的基因105个，下调基因164个，不同倍性水稻转录组样品在植物MAPK信号通路中均具有较多的差异表达基因。通过酵母双杂点对点实验，初步发现OsER2蛋白与OsKIN7L马达结构域蛋白具有互作，值得进一步研究。　　终上所述，驱动蛋白OsKIN7L在调控不同倍性水稻胚囊发育中具有重要的作用，但不同倍性水稻的调控方式可能存在差异，具体原因需进一步研究。

关键词： 云南省彝族   先天性心脏病   外显子测序   SLC2A3基因   单核苷酸变异  

摘要： 【研究背景及目的】先天性心脏病(Congenital Heart Disease,CHD)是新生儿最常见的出生缺陷,是导致婴幼儿非感染性死亡的最主要原因,其发病率呈逐年上升的趋势。流行病学调查显示:CHD患病率在不同人群存在差异,同时还有一定的家族聚集倾向。遗传因素在CHD的发生中起到重要作用。云南省是中国少数民族种类最多的省份,我们对云南省各地区进行CHD流行病学调查发现:云南省部分少数民族CHD患病率明显高于全国平均水平。本研究拟进一步开展如下工作:(1)对云南省部分少数民族CHD家系进行流行病学调查;通过对CHD家系内患者及亲属进行流行病学调查,了解CHD的临床特征和遗传方式。(2)对4个云南省彝族人群CHD家系共17名家庭成员进行基因组全外显子测序(Whole Exome Sequencing,WES),结合生物信息学分析和临床样本验证方法寻找CHD可疑致病基因和位点。项目的顺利实施将为云南省CHD防治提供理论依据。【方法】1、对云南省CHD生物样本信息库中400855例登记数据进行回顾,采用电话和术后复查方法随访分析确诊的2421CHD患者的临床资料,筛选统计CHD亚型和各民族患病率,获得16个少数民族CHD家系资料。收集这些家系中先证者、一级亲属和二级亲属的临床数据,填写CHD家系登记表,绘制CHD遗传谱系图,根据知情同意原则采集家庭成员血液样本;2、提取基因组DNA进行WES,通过个体化生信分析筛选出可疑致病基因位点作为候选;3、Sanger测序将假阳性位点排除,而后在242例云南省彝族散发CHD患者及242例健康对照样本进行临床样本验证。【结果】1、云南省CHD总体患病率为6.04‰,其中彝族患病率为7.95‰。16个少数民族CHD家系包括:傣族3例,白族4例,彝族4例,傈僳族3例,藏族2例。其中一级亲属患病率为33.93%(19/56),二级亲属患病率为9.38%(3/32),一、二级亲属患病率存在显著差异。2、少数民族家系先证者的疾病类型主要有:房间隔缺(Atrial septal defect,ASD)、室间隔缺损(Ventricular septal defects,V S D)、房室间隔缺损(Atrialventricular septal,AVSD)、卵圆孔未闭(Patent foramen ovale,PFO)。3、通过对4个彝族家系进行WES测序分析,筛选出59个候选基因位点,其中,F1和F2两个彝族家系的CHD患者均检测出SLC2A3(NM＿006931:exon8:c.1068+4C>T)位点单核苷酸变异。4、Sanger法检测临床样本该位点显示:在242例CHD患者中TT基因型38例,CT型154例,CC型50例;242例健康对照者中TT型14例,CT型96例,CC型132例,统计学分析后发现:3种基因型频率分布在CHD组和对照组之间有显著性差异(P<0.0001)。Logistic回归分析显示,CC基因型与CHD呈负相关(P<0.001;OR=0.236;95%CI:0.156-0.357)。两组间等位基因频率分布差异有统计学意义(P<0.0001)。Logistic回归分析显示,T等位基因与CHD呈正相关(P<0.001;OR=3.384;95%CI:2.59-4.42)。【结论】1、云南省CHD患病率高于全国平均水平,省内彝族CHD患病率高于全省平均水平;2、云南省少数民族CHD患者中一级亲属CHD发病率高于二级亲属,即与CHD患者亲缘关系越近,患有CHD可能性越大;3、SLC2A3(NM＿006931:exon8:c.1068+4C>T)位点单核苷酸C>T变异可能与云南省彝族人群CHD发生相关,与CT基因型相比,CC基因型罹患CHD的概率是CT基因型的0.236倍。携带等位基因T的人群患有CHD的风险是携带等位基因C的3.384倍。CC基因是云南省彝族人群CHD发生的保护性因素,等位基因T是云南省彝族人群CHD发生的危险因素。

关键词： 平凉红牛   群体遗传学   种质特性   选择信号   拷贝数变异  

摘要： 平凉红牛是我国优良的地方牛种资源,因其肉质细嫩、大理石花纹沉积能力强,具有极高的品种化培育价值。目前关于平凉红牛的研究主要集中在母系遗传起源及常规表型遗传研究等层面,而关于平凉红牛群体结构及种质特性的遗传基础等关键问题尚未得到很好地揭示。鉴于此,本研究利用基因组SNP芯片数据对平凉红牛的遗传多样性、群体结构及其系统发育关系进行了研究,并通过选择信号和拷贝数变异解析了平凉红牛优势性状的遗传基础。具体结果如下:（1）利用平凉红牛及其祖先品种在内的17个牛种基因组SNP芯片数据,在全基因组层面对平凉红牛与其他牛品种的遗传多样性、系统发育关系、群体结构和基因交流等进行分析。结果表明平凉红牛群体遗传一致性较好,且具有较高的遗传多样性;群体遗传结构和系统发育分析结果显示,平凉红牛具有自身特有的遗传特征,与其他牛品种明显分离,属于普通牛与瘤牛的混合血统,且比晋南牛、秦川牛、早胜牛、南阳牛、鲁西牛品种具有更多的普通牛血统。此外,研究还发现平凉红牛与中国地方牛品种有着更近的遗传距离,尤其是地理位置较近且为祖先品种的秦川牛,与之共享IBD片段最长;基因流分析显示来自欧洲的南德温、红安格斯向平凉红牛有基因交流。（2）利用群体内（i HS和CLR）和群体间(XP-EHH和F)四种选择信号分析方法对平凉红牛基因组上的选择痕迹进行扫描,研究发现平凉红牛基因组上与机体脂肪沉积、生长发育、繁殖和免疫应答等性状相关的基因组区域受到潜在选择,并且功能富集分析结果显示这些潜在选择区域内的基因显著富集于代谢、免疫等相关的生物学功能。其中,RFX4、RIC8B、TMEM263、MTERF2、CRY1、PEBP4、SYT10和ATRN等与嗅觉受体、骨骼发育、繁殖、色素沉着和免疫等功能相关的基因在四种选择信号分析方法的至少三种中检测到。（3）为深入解析平凉红牛的种质特性,通过Penn CNV软件检测平凉红牛基因组上的拷贝数变异,共检测到755个CNVRs,长度范围在1.01 kb到4.44 Mb之间,平均大小为107.32 kb,总长度为81.03Mb,覆盖3.24%的常染色体基因组。通过基因组信息注释,鉴定到1,219个与CNVRs存在重叠的基因,其显著富集于与嗅觉、味觉、氧气结合、氧气运输、离子结合和脂肪酸代谢等相关生物学功能。结合Cattle QTL数据库中的信息,发现73个基因与牛的经济性状相关,包括与肌内脂肪沉积、第十二肋部脂肪厚相关的TG、CDH12、ITGA9和CACNA2D1等,与生长性状相关的CYP21、CYLD、KCNIP4、CCKBR、PCCA和PRSS2等基因。此外,选择信号分析鉴定到的CACNA2D1、GALNT13、NADK和ACACA等51个潜在选择基因也存在于其基因组CNVRs内。综上,本研究对平凉红牛的系统发育地位和种质特性的遗传基础进行了探究,发现平凉红牛已形成自身独特的遗传结构,其基因组上的选择信号和拷贝数变异对其种质特性的形成具有重要作用,研究结果为该遗传资源的选育、保护和开发利用提供了有价值的遗传学见解。

关键词： microRNA   cerebral blood flow   bipolar disorder   GWAS   mitochondria   Psychiatry   fMRI   magnetic resonance spectroscopy   MRI  

ISBN: (数字)9780197574539 ISBN: (纸本)9780197574522

摘要： Leading experts in neuroimaging and genetics discuss recent discoveries in bipolar disorder that identify the structural, functional, and chemical brain changes that seem to underlie this condition, as well as possible genetic causes of these brain events. This book is a resource to guide clinicians as they struggle to understand this illness and provides a new framework for understanding bipolar disorder in order to, ultimately, develop improved therapies for affected individuals and novel strategies to prevent the onset in children at risk for this condition.

关键词： 祖源推断   DIP   PCR-CE   宁夏汉族   湖南汉族   裕固族  

摘要： 研究背景:法医祖源推断通过检测具有种群差异的相关指标,从而得到样本的生物地理祖先来源,从而为案件侦查和诉讼活动提供帮助。缺失/插入多态性(Deletion/Insertion Polymorphisms,DIPs)在基因组中分布广泛、突变率低、部分位点在群体中频率差异较大,能够应用于法医祖源推断;且其片段长度短,无stutter峰,在陈旧、降解检材的分型中具有极大的优势,具有良好的法医学应用前景。DIPs为长度多态性遗传标记,能够使用目前常用的基于聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)的毛细管电泳(Capillary Electrophoresis,CE)平台和二代测序平台进行检测。由于本研究旨在研发一款能够广泛应用于法医实验室的试剂盒,而PCR-CE平台为目前法医检案工作中的主要平台,故本研究采用了准确性高、成本低、单次实验耗时短的PCR-CE平台进行体系的构建。我国地处东亚,民族较多,南方群体与北方群体在遗传结构上具有一定的差异,因此,我们希望建立能够在区分五大洲际人群的基础上,对东亚群体进行更加精确区分的的祖源推断DIP体系,并使用新建立的体系对占我国绝大多数人口的汉族群体以及人口数量极少的裕固族群体进行群体遗传学分析及法医学应用评估。研究方法:首先,在dbSNP数据库中筛选适用于祖源推断的常染色体二等位DIP位点,保证其在亚洲群体中满足HWE和LD;然后使用1000 Genomes Project Phase 3中的数据对位点的法医学应用效能进行初步评估;接下来使用筛选的 56 个 A-DIPs(Autosomal-DIPs)、3 个 Y-DIPs(Y chromsomal-DIPs)、与性别基因Amelogenin一起构建复合扩增体系,并按照DNA分析方法科学工作组(SWGDAM)提供的指南对其进行验证。最后使用新构建的体系对湖南汉族、宁夏汉族、甘肃裕固族进行扩增,使用STRAF、Snipper v 2.5、R软件、STRUCTURE v2.3.4、Mega 7、TreeMix和TBtools进行遗传学参数的计算及分析、法医学参数的计算及随机森林模型的构建。研究结论:基于PCR-CE平台构建的法医祖源推断体系60-panel具有良好的性能,其扩增子片段在200bp以内、灵敏度高、特异性强,适用于法医降解检材的分析。体系包含的56个A-DIPs对5大洲际群体和东亚南、北部群体具有良好的区分能力。通过对宁夏汉族、湖南汉族和甘肃裕固族进行遗传学分析,结果显示宁夏汉族具有典型的东亚北部遗传特征,而湖南汉族处于东亚南北部的过渡地带,遗传结构具有较多东亚南部特征,裕固族也表现出典型的东亚北部特征。通过计算法医学参数,显示该体系可以应用于法医学个体识别。通过构建随机森林模型,推断宁夏汉族属于东亚北部的准确率达到93.71%;湖南汉族属于东亚南部的准确率为88.63%,裕固族属于东亚北部的准确率为96.90%,具有较高的祖源推断效能。

摘要： 表观遗传的概念长期以来一直存在争议。一些研究人员希望有关环境暴露的跨代影响的新数据将有助于解决此争论。黑松露是表观遗传学家安德里亚·巴卡雷利（Andrea Baccarelli）的偏爱。根据这位现任哥伦比亚大学梅尔曼公共卫生学院环境健康科学系主任的说法，他的父母也喜欢黑松露，祖父母甚至曾祖父母亦然。他怀疑自己可能顺着某种生物学机制继承了前几代人的偏好，又或者，这种多代人的块菌之爱似乎与生活环境有关：他们作为盛产黑松露的意大利翁布里亚地区的居民，家宅周围常有黑松露。

关键词： 先天性双侧输精管缺如   文献计量分析   囊性纤维化跨膜转导调节因子   囊性纤维化   男性不育症   CBAVD   生育的结局   经皮附睾穿刺取精术   卵胞浆内单精子注射技术   CFTR   中国汉族   拷贝数变异  

摘要： 第一部分 CBAVD的全球研究趋势:文献计量和可视化研究目的:对有关先天性双侧输精管缺如(CBAVD)的文献进行计量学分析,探讨该研究领域的特点及热点问题。方法:从WoSCC数据库检索有关CBAVD研究的文献,根据纳入与排除标准进行筛选并下载其相关的数据,使用CiteSpace和VOSviewer软件进行该领域的文献计量分析。结果参数为作者、论文发表数量、主要贡献机构及国家、发表期刊影响因子、文献被引分析、热门关键词、关键词随着时间的演化变迁等。此外,还提供了网络合作关系图来评估它们之间的合作关系。结果:最终共纳入分析的文献有918篇。自1998年以后,发表文献数量呈现逐渐减少趋势。《Human Reproduction》是发表论文最多的期刊,共发表69篇文章,同时也是被共同引用最多的期刊。Silber Sj,Asch Rh和Patrizio P是发表该领域最多论文的研究人员,并且在发文较多的作者之间有积极的合作关系。美国是该领域的主要贡献的国家,发表了 231篇论文,其次是法国、意大利、英国、德国、中国等。该领域研究的热门关键词包括 vas deferens、cystic fibrosis、congenital bilateral absence、mutations、infertility、CFTR等话题。结论:对CBAVD这一相对罕见疾病研究文献的分析和历史回顾将有助于进一步研究的开展,为我们的研究提供方向。同时可对热点问题的具体领域进行深入探索提供参考。第二部分CBAVD患者的临床特点对生育结局的影响目的:探索先天性双侧输精管缺如(CBAVD)患者的临床特点对生育结局的影响。方法:本研究纳入的对象是2005年至2020年我院泌尿男科门诊就诊的CBAVD患者。收集患者的一般临床信息,包括年龄、既往病史、备孕持续时间、性激素五项化验、精液常规化验、经皮附睾穿刺取精术获得的精子参数、精囊的发育情况、随访卵胞浆内单精子注射技术(ICSI)患者的生育结果,比较男性临床因素对生育结果的影响。结果:最终共有172名CBAVD患者被纳入研究。CBAVD患者夫妻总共进行了 211个ICSI周期,活产率为43.60%。共有126例活产婴儿,男婴57例(45.24%),女婴69例(54.76%)。第一次ICSI周期中,成功夫妻与失败夫妻之间在CBAVD患者的年龄(P=0.09)、睾丸容积(左侧 P=0.96,右侧 P=0.41)、FSH(P=0.65)、LH(P=0.58)、PRL(P=0.62)、T(P=0.82)和 E2(P=0.18)、射精量(P=0.79)、精液pH值(P=0.78)、PESA精子质量参数(精子的浓度和活力)(P>0.05)等方面没有明显差异。第一次ICSI周期成功夫妻与多次ICSI周期失败夫妻(≥2次ICSI周期)在上述男性因素方面同样没有显著差异(P>0.05)。结论:本研究提示CBAVD患者的临床特点对生育结果无明显影响。第三部分中国汉族CBAVD患者CFTR基因CNVs分析目的:先天性双侧输精管缺如(CBAVD)是引起男性不育的重要疾病,占不育人群的1%～2%。除了常见的CFTR突变外,拷贝数变异(CNVs)也被认为是CBAVD的发病机制之一。本研究旨在探讨中国汉族CBAVD患者CFTR基因的CNVs的遗传贡献。方法:共纳入CBAVD患者263例,从其外周血样本中提取基因组DNA。针对CFTR基因的区域进行多重连接探针扩增(MLPA)实验,检测CFTR基因的CNVs,并分析其致病性。结果:本研究263例中国汉族男性CBAVD患者中,有5例(1.90%)患者在CFTR基因区域检测到拷贝数变异(其中4例携带CFTR基因部分缺失,1例携带CFTR基因部分重复)。5例中检测出有3种CNVs(外显子14-15缺失、外显子22-24缺失和外显子18-20缺失)被认为是具有致病性的。结论:本研究显示,中国CBAVD患者CFTR基因的CNVs发生率与既往报道基本一致。而本研究首次在中国汉族大样本量CBAVD患者中发现CFTR基因的CNVs的遗传风险,提示有必要在中国汉族CBAVD患者中检测CFTR基因的CNVs。

关键词： 生信分析   DNA甲基化   mRNA   lncRNAs   基因整合分析   表观遗传学   乳腺癌  

摘要： 乳腺癌已成为全球发病率最高的恶性肿瘤,并且是女性癌症死亡的第二大原因,仅次于肺癌。乳腺癌发生的分子机制复杂,在乳腺癌的发生过程中会伴随着mRNA、lncRNA和DNA甲基化的变化。本课题研究对乳腺癌患者癌组织和癌旁组织进行转录组测序,从数据库中获取这些信息并进行分析,再入组早期乳腺癌患者进行分子生物学验证,旨在确定与早期乳腺癌(EBC)诊断和预后相关的关键分子标记物。第一部分利用生物信息学技术对早期乳腺癌的DNA甲基化和基因数据库整合分析研究其表观遗传学特征目的:通过高通量测序技术,挖掘TCGA数据库早期乳腺癌高通量数据,确定与早期乳腺癌(EBC)诊断和预后相关的关键分子标记物。方法:从癌症基因组图谱(TCGA)数据库中下载乳腺癌相关的mRNA、lncRNA和DNA甲基化数据,用于鉴定差异表达的mRNAs(DEmRNAs)、差异表达的lncRNAs(DelnRNAs)和DNA甲基化分析。通过GO富集分析、KEGG通路分析,鉴定差异表达mRNA的生物学功能及参与的信号通路。对DNA甲基化与差异表达mRNAs进行相关性分析,并对已识别的差异表达mRNA和差异lncRNAs进行诊断分析和预后分析。最后,利用GSE32393数据集对已识别差异表达mRNA进行甲基化状态验证。结果:通过生信分析获得1633个差异表达mRNA、750个差异lncRNA和8042个差异甲基化位点。通过GO富集和KEGG通路分析鉴定差异表达mRNA的生物学功能,发现大多数DEmRNA参与细胞活动、细胞周期、转录等。在Venn分析中,我们发现了11个关键基因(ALDH1L1、SPTBN1、MRGPRF、CAV2、HSPB6、PITX1、WDR86、PENK、CACNA1H、ALDH1A2和MME)。利用ROC曲线对11个差异表达mRNA的诊断价值进行分析,发现ALDH1A2(高甲基化)、ALDH1L1(高甲基化)、HSPB6(高甲基化)、MME(高甲基化)、MRGPRF(高甲基化)、PENK(高甲基化)、PITX1(低甲基化)、SPTBN1(高甲基化),WDR86(高甲基化)和CAV2(高甲基化)可能被认为是早期乳腺癌潜在的诊断基因生物标记物。小结:1.通过生物信息学研究获得1633个差异表达mRNA、750个差异lncRNA和8042个差异甲基化位点,并发现大多数DEmRNA参与细胞活动、细胞周期、转录等。2.在Venn分析中,我们发现了11个关键基因(ALDH1L1、SPTBN1、MRGPRF、CAV2、HSPB6、PITX1、WDR86、PENK、CACNA1H、ALDH1A2和MME)。并发现除CACNA1H外,其余10个基因可能被认为是早期乳腺癌潜在的诊断基因生物标记物。第二部分临床样本验证DNA甲基化和基因整合分析获得的差异基因目的:运用RT-PCR技术,在临床样本中检测验证差异表达的基因。方法:获取6例早期乳腺癌组织样本(疾病组)和癌旁组织样本(对照组)进行RT-PCR。使用TRIzol试剂盒提取总RNA,使用Fast King c DNA第一链合成试剂盒进行mRNA的逆转录;然后使用Super Real Pre Mix Plus试剂盒进行实时定量荧光PCR确定基因的差异表达变化,使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和肌动蛋白β(ACTB)被用作内参照物。使用2方法计算相对基因表达水平。结果:与癌旁组织相比,早期乳腺癌组织的CAV2、MME、FHL1、CAV1、LINC01537、TRHDE-AS1表达下调,CACNA1H的mRNA表达下调到癌旁组织的0.27,CAV2的mRNA表达下调到癌旁组织的0.18,MME的mRNA表达下调到癌旁组织的0.09,FHL1的mRNA表达下调到癌旁组织的0.43,CAV1的mRNA表达下调到癌旁组织的0.57,LINC01537的表达下调到癌旁组织的0.37,TRHDE-AS1的mRNA表达下调到癌旁组织的0.40。LINC01614和FOXD3-AS1在早期乳腺癌组织中表达上调,LINC01614的表达上调到癌旁组织的13.51,FOXD3-AS1的mRNA表达上调到癌旁组织的3.59,这与生物信息学分析的结果一致,除CAV1和FOXD3-AS1外,其余基因的表达均存在显著性差异(P<0.05)小结:与癌旁组织相比,早期乳腺癌组织的CAV2、MME、FHL1、CAV1、LINC01537、TRHDE-AS1表达下调,LINC01614和FOXD-3-AS1在早期乳腺癌组织中表达上调,而CACNA1H和ENSG0000261294与生物信息学分析结果相反,造成这种差异的原因可能是由于样本量小造成的,需要进一步的研究。第三部分细胞学水平验证AC093110.1在早期乳腺癌中的作用机制目的:在细胞水平探讨AC0

关键词： 结构畸形胎儿   全基因组测序技术   遗传学病因   染色体异常   基因突变   动态突变  

摘要： 背景和目的先天畸形是围产儿和新生儿死亡的主要原因、危害严重,其中遗传因素是其主要病因,对畸形胎儿进行于遗传学检测十分重要。目前临床上主要采用染色体核型分析和染色体微阵列分析技术(chromosomal microarray analysis,CMA)检测非整倍体和拷贝数变异(copy number variations,CNVs),采用外显子测序技术(exome sequencing,ES)检测单基因变异等。这两种技术单独使用,检测效果欠佳;如果采用CMA+ES序贯检测,则费用大大增加且报告周期很长,增加了孕妇及其家庭的焦虑,同时仍有小的基因缺失、动态突变等无法检测。因此,深入探讨和研究新型、高效、快捷的产前遗传学检测技术,实现一次性检测就可获得胎儿的全部遗传学变异信息,有着重要的价值。本研究通过全基因组测序技术(whole genome sequencing,WGS)以及建立的数据分析和报告体系,对185例超声检测发现的结构畸形胎儿进行遗传学检测,寻找结构畸形胎儿的遗传学病因,并系统评估WGS技术用于结构畸形胎儿产前检测的临床可行性,包括可检出的变异类型、准确性、报告时间等。方法1.采用WGS技术对185例结构畸形胎儿进行检测,寻找结构畸形胎儿的遗传学病因;2.比较WGS与CMA两种技术在畸形胎儿中非整倍体和CNVs的检出情况;采用Sanger测序技术验证WGS技术检出的基因变异;采用片段长度分析法验证动态突变的准确性。结果1.采用WGS技术对185例结构畸形胎儿进行检测,发现20例(10.8%)结构畸形胎儿存在染色体异常,其中非整倍体12例、CNVs8例;此外,WGS技术还发现1例COL4A2基因2.1kb缺失变异、7例(3.8%)与结构畸形相关的基因点突变及3例其它致病性变异位点(与超声结构畸形无关);总体异常发现为31例,异常发现率为16.8%;2.与CMA技术相比,WGS检出的20例染色体异常(非整倍体12例,CNVs8例)与CMA检出结果一致;WGS额外发现1例COL4A2基因2.1kb缺失,是CMA技术无法检出的变异;***检测发现7例(3.8%)与胎儿畸形相关的点突变和小的插入/缺失(insertions/deletions,indels),涉及BBS12、SOS1、PTPN11、GLI3、B3GALTL、PKHD1和HSPA9基因;7例Sanger测序验证结果与WGS检测结果完全一致;4.检测发现3例结构畸形胎儿存在与胎儿当前结构畸形不相关的致病性变异位点,分别为ATXN3基因的动态突变、ATRX基因的剪切位点变异和ANXA11的杂合错义突变;***技术检测周期为2-3周,样本用量为200ng左右,较CMA+ES的序贯性检测时间(4-6周)短、需要的样本量(450ng左右)少。结论***技术可以检测非整倍体、CNVs,与CMA相比其准确性、灵敏度、特异性均为100%;2.较目前临床上广泛采用的CMA技术,WGS技术还可同时检出<100kb的片段异常及提示动态突变,可以额外发现小片段CNVs和动态突变疾病,但是检测灵敏度及特异性还需要进一步扩大样本评估;***可检测多种变异类型,且检测周期短、样本用量少等优势,随着测序成本持续下降和测序数据分析能力快速提升,WGS很快会成为结构畸形胎儿遗传学病因检测的一线技术;