关键词：
动脉粥样硬化
环指蛋白20
组蛋白H2B泛素化
基因表观遗传学
核因子-κB
巨噬细胞迁移
摘要：
目的本研究选用氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)刺激的RAW264.7小鼠巨噬细胞系构建巨噬细胞迁移炎症模型,模拟动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS),观察环指蛋白20(ring finger protein 20,RNF20)、组蛋白H2B泛素化(Ubiquitin of histone H2B,H2Bub)、核因子-κB(Nuclear factor kappa B,NF-κB)、白介素1β(Iterleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)蛋白相对表达量及巨噬细胞迁移的数目改变,并通过细胞功能获得实验使RNF20因子过表达,进一步探讨RNF20调控的H2Bub基因表观遗传学在巨噬细胞迁移及炎症反应中的作用特点,阐明组蛋白泛素化修饰的基因表观遗传学对AS的具体调控机制,为AS早期检测预防和治疗开拓新的研究方向。方法本研究选用RAW264.7小鼠巨噬细胞系,培养在10%的胎牛血清和1%的青链霉素的DMEM培养基中,置于37℃,CO2浓度为5%的细胞敷育箱中,选取8-10代生长状态良好的小鼠巨噬细胞系进行处理分组。实验分组:空白对照组;ox-LDL处理组;RNF20过表达组;RNF20过表达对照组;NF-κB兴奋剂(佛波醇脂组);NF-κB抑制剂(SN50组)。空白对照组小鼠巨噬细胞系不作任何处理培养48h;ox-LDL处理组小鼠巨噬细胞系用20mg/L的ox-LDL刺激48h;RNF20过表达组将oe-RNF20转染小鼠巨噬细胞后,再用20mg/L的ox-LDL刺激48h;RNF20过表达对照组将空白质粒转染小鼠巨噬细胞后,再用20mg/L的ox-LDL刺激48h;佛波醇脂组用1μmol/L的佛波醇脂处理小鼠巨噬细胞24h后,再用20mg/L的ox-LDL刺激24h,共刺激48h;SN50组用20μmol/L的SN50处理小鼠巨噬细胞24h后,再用20mg/L的ox-LDL刺激24h,共刺激48h。采用免疫学印迹(Western Blot,WB)实验方法检测RNF20、H2Bub、TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白的表达情况;Transwell实验方法检测巨噬细胞迁移数目变化。结果1.各组巨噬细胞中相关蛋白的表达情况与空白对照组比较,ox-LDL处理组中TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白相对表达量明显增加,差异具有统计学意义(P<0.01);RNF20、H2Bub蛋白相对表达量明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。与ox-LDL处理组比较,RNF20过表达组中RNF20、H2Bub蛋白相对表达量明显增加,差异具有统计学意义(P<0.01),TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白相对表达量明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01);与ox-LDL处理组比较,RNF20过表达对照组中RNF20、H2Bub、TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白相对表达量无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05);佛波醇脂组中RNF20、H2Bub蛋白相对表达量无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05),TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白相对表达量明显增加,差异具有统计学意义(P<0.01);SN50组中RNF20、H2Bub蛋白相对表达量无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05),TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白相对表达量明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。2.各组巨噬细胞迁移结果与空白对照组比较,ox-LDL处理组中巨噬细胞迁移数目明显增加,差异具有统计学意义(P<0.01)。与ox-LDL处理组比较,RNF20过表达组中巨噬细胞迁移数目明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01);RNF20过表达对照组中巨噬细胞迁移数目无明显改变,差异无统计学意义(P>0.05);佛波醇脂组中巨噬细胞迁移数目明显增加,差异具有统计学意义(P<0.01);SN50组中巨噬细胞迁移数目明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论(1)在使用oxLDL刺激的巨噬细胞后,TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白相对表达量增加,巨噬细胞迁移数目增加,提示巨噬细胞迁移炎症模型构建成功。(2)本研究发现在巨噬细胞迁移炎症模型中RNF20和H2Bub蛋白相对表达量降低,且两者呈正相关,RNF20调控的H2Bub作为AS的保护因素,参与AS的发生发展。(3)本研究发现在过表达RNF20后,RNF20、H2Bub蛋白相对表达量不变,TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白相对表达量降低,巨噬细胞迁移数目降低。阐明组蛋白泛素化可以影响基因表观遗传学从而调控炎症因子表达水平,进而改变AS
