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关键词： acute myeloid leukaemia   apoptosis   chemoresistance   microRNAs   target genes  

摘要： Cytarabine and daunorubicin are old drugs commonly used in the treatment of acute myeloid leukaemia (AML). Refractory or relapsed disease because of chemotherapy resistance is a major issue. microRNAs (miRNAs) were incriminated in resistance. This study aimed to identify miRNAs involved in chemoresistance in AML patients and to define their target genes. We focused on cytogenetically normal AML patients with wild-type NPM1 without FLT3-ITD as the treatment of this subset of patients with intermediate-risk cytogenetics is not well established. We analysed baseline AML samples by small RNA sequencing and compared the profile of chemoresistant to chemosensitive AML patients. Among the miRNAs significantly overexpressed in chemoresistant patients, we revealed miR-15a-5p and miR-21-5p as miRNAs with a major role in chemoresistance in AML. We showed that miR-15a-5p and miR-21-5p overexpression decreased apoptosis induced by cytarabine and/or daunorubicin. PDCD4, ARL2 and BTG2 genes were found to be targeted by miR-15a-5p, as well as PDCD4 and BTG2 by miR-21-5p. Inhibition experiments of the three target genes reproduced the functional effect of both miRNAs on chemosensitivity. Our study demonstrates that miR-15a-5p and miR-21-5p are overexpressed in a subgroup of chemoresistant AML patients. Both miRNAs induce chemoresistance by targeting three pro-apoptotic genes PDCD4, ARL2 and BTG2.

关键词： 反向遗传学   流感病毒   蔓荆子   筛药工具  

摘要： 【背景】世界卫生组织统计,每年全球因流感而感染的约10亿人,死亡的人数约达30至50万[1]。流感有4型,分别是甲型流感、乙型流感、丙型流感和丁型流感(2011年发现),其中甲型流感致病性和传染性最强,致死率最高;目前治疗流感病毒的方法有接种流感疫苗和抗病毒药物的应用(包括中医药抗流感病毒)。而由于流感病毒为RNA病毒,具有很强的突变能力,容易导致抗原漂移和抗原转变,使得疫苗失效、病毒对抗流感药物出现耐药。所以需要筛选更多的药物,比如中药,以应对未来可能再一次出现的流感大流行。目前筛药的方法常见的有MTT法,但此方法可重复性低,实验步骤繁琐,耗时长,所以需要可用于大量筛药的更直接高效的方法替代。本课题运用反向遗传学,制备携带m Cherry基因的甲型流感病毒,可为抗流感中药的筛选提供有力的工具。流感在中医上可认为是疫病。在古代,对疫病的治疗,中医中药发挥着及其重要的作用;而去年的新型冠状病毒,对中医中药的运用,更是大大降低了死亡率。蔓荆子,为马鞭草科植物蔓荆的干燥成熟果实,有疏散风热,清利头目的功效,为中医感冒方剂中的常用药物。但鲜少有文献对其抗病毒作用进行研究,本文选取蔓荆子的水提物,验证其对新甲流是否有抗病毒作用。【目的】(一)运用反向遗传学构建新甲流H1N1携带m Cherry红色荧光报告基因的重组流感毒株;通过BABL/C小鼠传代产生新甲流H1N1老鼠适应毒株以及构建携带m Cherry基因的老鼠适应毒株。(二)通过核酸、蛋白、荧光的方法验证携带m Cherry基因的重组H1N1病毒是否能稳定存在且成功表达红色荧光。再从聚合酶活性、动物致病性两个方面探究该重组病毒的特性。(三)初步探索中药蔓荆子水提物是否有抗流感病毒的作用。【方法】(一)利用反向遗传学构建PA-m Cherry质粒,拯救携带m Cherry基因的新甲流H1N1重组流感病毒,同样的方法拯救H1N1老鼠适应性毒株及其携带m Cherry基因的重组病毒。(二)运用PCR、蛋白印迹实验、间接免疫荧光等实验方法验证重组流感病毒的基因稳定性和报告基因的表达;评估病毒在体外复制的生长动力学,荧光素酶报告测定聚合酶活性以及测定病毒对小鼠的半数致死量(MLD),探究病毒的特性。(三)用噻唑蓝染色法(MTT法)、子代病毒产量减少法探究中药蔓荆子水提物对甲型流感病毒H1N1的抗病毒作用。运用携带m Cherry基因的重组H1N1病毒作为筛药的工具,通过荧光法初步探究蔓荆子水提物的抗病毒作用。【结果】(一)携带m Cherry基因的重组H1N1病毒的构建利用反向遗传学方法在A/Guangdong/GLW/2018(H1N1)(GLW-WT)病毒的PA基因片段中找到合适的包装信号位点,将m Cherry基因插入PA基因中,成功制备出携带红色荧光基因、表达红色荧光蛋白并具有复制传代能力的甲型重组流感病毒(GLW-WT-m Cherry)。接着,将GLW-WT病毒在小鼠中进行适应性传代,分离纯化出对小鼠有致病性的病毒GLW-MA;将m Cherry基因插入GLW-MA病毒的PA基因后,成功拯救携带红色荧光基因、表达红色荧光蛋白的小鼠适应性重组流感病毒(GLW-WT-m Cherry)。这为抗病毒药物的体外和体内筛选提供了强有力的工具。(二)病毒特性的研究运用病毒体外复制的生长动力学,PCR,蛋白质印迹,间接免疫荧光等方法证明携带m Cherry基因的重组H1N1病毒能够容纳完整的PA-m Cherry基因,并且在MDCK细胞中成功表达红色荧光蛋白。通过对GLW-MA病毒基因测序,与GLW-WT病毒基因序列进行比对,新甲流病毒的老鼠适应毒株GLW-MA产生基因突变,通过荧光素酶报告检测证明PA I61M、E351K、G631S三个氨基酸突变位点能够增加聚合酶复合体的聚合酶活性。PA和HA的基因突变可能是GLW-MA病毒产生小鼠适应性的分子因素。GLW-WT(H1N1)病毒对小鼠没有致病性,GLW-MA毒株和GLW-MA-m Cherry毒株对小鼠均有致病性。(三)探究蔓荆子水提物的抗病毒作用通过MTT法测得蔓荆子水提物对GLW-WT病毒的体外IC值为7.78±1.21μg/m L;通过子代病毒产量减少法表明,随着药物浓度的升高,子代病毒产量逐渐减少。运用GLW-WT-m Cherry病毒作为筛药工具,运用荧光法证明蔓荆子水提物对GLW-WT-m Cherry病毒的作用;结果表明,随着药物浓度的增大,GLW-WT-m Cherry病毒在MDCK细胞中的荧光表达越来越少。初步证明蔓荆子水提物具有抗病毒作用。【结论】利用反向遗传学成功构建携带m Cherry基因的重组流感病毒GLW-MA-m Cherry和GLW-WT-m Cherry。运用携带m Cherry基因的重组流感病毒GLW-W

关键词： 肾脏纤毛病   常染色体显性多囊肾病(ADPKD)   常染色体隐形多囊肾(ARPKD)   肾单位肾痨(NPHP)   Joubert综合征   二代测序  

摘要： 研究目的:纤毛是一种以微管为基础的细胞器,根据超微结构可分为动力纤毛和初级纤毛。肾脏的初级纤毛作为肾单位的机械感受器,通过触发信号传导对液体流动做出反应,以维持细胞增殖与代谢的平衡,其功能受损可使肾小管上皮细胞过度增殖,导致囊肿的形成,所引起的疾病称为肾脏纤毛病,包括常染色体显性多囊肾病（ADPKD）、常染色体隐形多囊肾（ARPKD）、肾单位肾痨（NPHP）、Joubert综合征、Bardet-Biedl综合征、Senior-Loken综合征等。此类疾病拥有类似的基本临床表现,但在此基础上又各有差异。二代测序的发展使肾脏纤毛病及相关基因的作用机制为大家熟识。本文主要对肾脏纤毛病的临床特征、基因型等资料进行分析,旨在为肾脏纤毛病的诊断、鉴别等提供参考。研究方法:本研究招募了从2015年1月至2020年10月于浙江大学附属儿童医院肾内科就诊考虑肾脏纤毛病的患者,收集其家族史、临床表现和实验室检查结果,并进行全外显子基因序列测定,以评估临床表型、基因型及它们之间的联系。结果:共纳入38名患者,包括16例ADPKD,8例ARPKD患儿,NPHP患儿9例,Joubert综合征1例,多囊肾患儿4例。42.1%的患儿在确诊时没有明显的临床症状,但55.2%的患儿有尿检异常,47.4%的患儿出现肾功能损害。38例患者中有34例患儿存在相应的突变基因,共检出45个纤毛相关基因突变位点,其中包含PKD1基因突变18个（43.9%）,PKD2突变1个（2.4%）,PKHD1突变15个（36.6%）,NPHP1突变3个（4.8%）、NPHP3突变基因6个（9.8%）,INVS、AHI1突变基因各1个（2.4%）。检测到的18个PKD1基因突变中,最常见的是错义突变（11个,占61.1%）,6个基因突变位点未曾报道过。在PKD2基因中发现1个突变,突变类型为已报道过的错义突变。在检测到的15种PKHD1基因突变中,最常见的是错义突变（10个,占66.7%）,其中5个位点未被报道过,NPHP1检测到3个突变类型,c.617A＞T为新发突变,NPHP3中检测到6个突变,其中c.3442A＞T;c.3870＿c.3873del A AAA、IVS26-3A＞G为新发突变,INVS、AHI1各检测到1个突变位点。同时我们对临床表现与基因型进行对比分析,ADPKD与ARPKD的临床表型与突变基因的类型无明显关联,NPHP1突变多在青少年期进入尿毒症期,NPHP3、INVS多表现为婴幼儿期的肾功能衰竭。结论:（1）肾脏纤毛病在临床并不罕见,但其临床表现较隐匿,有些病例在出现表型之前就可能存在尿检异常或肾功能的损害。（2）在中国儿童人群中肾脏纤毛病中最常见的疾病类型是ADPKD、ARPKD、NPHP,分别对应的最常见突变基因为PKD1、PKHD1、NPHP1。（3）ADPKD与ARPKD的临床表型与突变基因类型无明显关联,NPHP1突变多在青少年期进展为ESRD,NPHP3、INVS多在婴幼儿期进展为ESRD。

关键词： 光遗传学   活细胞成像   线粒体   隐花色素2   腺嘌呤核苷三磷酸   活性氧  

摘要： 线粒体是真核细胞中非常重要的细胞器。线粒体分裂和融合的平衡,其在细胞内的分布与定位变化等对细胞稳态的维持起着至关重要的作用。然而,目前由于缺乏有效的精准调控手段,针对线粒体的形态变化、在细胞内的定位分布与其功能之间的关联性还不甚明了。本论文利用光遗传学工具实现了活细胞内线粒体聚集分布与定位的快速光学操控,结合活细胞显微成像技术研究了光操控过程中线粒体分布与定位的动态变化情况,并应用生化手段探究了瞬时与可逆性光学操控对细胞线粒体功能所造成的影响。本文的主要研究内容总结如下:1、光遗传学操控活细胞线粒体聚集分布的研究基于CRY2-CIBN系统的二聚化和CRY2high的低聚化作用,通过蓝光刺激光控蛋白元件Opto-Mito C（Tom20-CIBN-GFP、m Cherry-CRY2high）在COS-7细胞中实现光控线粒体的聚集分布,并进行实时显微成像及聚集程度的定量分析。研究表明:（1）Opto-Mito C能成功诱导细胞中线粒体的光控聚集;（2）建立图像熵值算法实现了对线粒体聚集程度的定量分析;（3）尽管光控蛋白元件OptoMito C具有可逆性,能在撤去蓝光刺激之后解聚,但其所引起的细胞线粒体的聚集分布是不可逆的。2、线粒体往细胞膜周快速运输定位的光操控研究利用包含驱动蛋白家族成员5A的质粒KIF5A-CIBN-GFP和定位于线粒体外膜的Miro1-m Cherry-CRY2光控蛋白元件,光控COS-7细胞的线粒体快速地向细胞膜周运输,并进行实时追踪成像及线粒体分布的定量分析。研究表明:（1）通过光照募集驱动蛋白至线粒体外膜可以实现线粒体向细胞膜周快速运输的光遗传学操控;（2）通过核周荧光面积与全细胞荧光面积比值的变化可以定量分析线粒体向细胞膜周运输的程度;（3）光控驱动蛋白诱导的线粒体膜周定位改变了线粒体形态结构,且不完全具有可逆性。3、光控线粒体聚集分布及向细胞膜的运输对线粒体功能的影响研究研究表明:（1）光控Opto-Mito C诱导的线粒体聚集可显著改善Niclosamide药物引起的线粒体功能异常,可上调细胞ATP水平,降低细胞中ROS含量及减少线粒体通透性转换孔的开放程度,并且此影响不具有光控的可逆性;（2）光控驱动蛋白诱导的线粒体向细胞膜的运输会造成COS-7细胞的ROS含量上调、ATP水平上升,在短期内此影响不具有可逆性。总之,本论文研究建立了活细胞内线粒体聚集分布及定位的光遗传学操控方法,结合图像定量处理分析技术与生化手段,探究了线粒体形态及分布的改变情况及其对细胞线粒体功能产生的影响。这些研究成果可加深对细胞线粒体生理机制的进一步了解,为今后开展线粒体定位与功能的研究提供了新的方法。

关键词： 结直肠腺瘤   脾虚证   DNA甲基化   RNA甲基化m6A修饰   蛋白乙酰化   四君子汤  

摘要： 目的:明确脾虚证在结直肠腺瘤(Colorectal adenomas,CRA)的流行规律及其表观遗传学基础,并评估益气健脾经典方剂四君子汤对CRA脾虚证的干预效应及潜在机制,为病证结合CRC的早期诊断、早期治疗提供临床证据。方法:采用课题组研制的脾虚证患者报告结局(Patient reported outcomes,PROs)量表对1026例镜下诊断为CRA的患者进行脾虚证评分,获得脾虚证在CRA人群的流行数据,分析脾虚证评分与年龄、性别之间的关系;利用高通量测序检测CRA组织样本中DNA甲基化、RNA甲基化m6A修饰及蛋白乙酰化的变化,分析DNA甲基化、RNA甲基化m6A修饰及蛋白乙酰化在脾虚证CRA中的变化规律及作用机制;开展四君子汤治疗脾虚证CRA配对对照临床试验,根据方证相应原理,研究四君子汤对CRA患者脾虚证评分改善及DNA甲基化的调控作用。结果:1.脾虚证PRO量表测评发现,1026例CRA患者中有655例(占比64%)患有不同程度脾虚证,371例(占比36%)CRA患者未见有明显脾虚证表现,说明脾虚证是CRA的主要流行证候。在脾虚证CRA患者中,男性占比70.4%,女性占比29.6%,男女比例约为2.4:1。而50岁以上是CRA的好发年龄,皮尔逊相关性分析发现,脾虚证评分与CRA患者的年龄成正相关。***甲基化测序结果表明;与非脾虚证CRA相比,脾虚证CRA患者中差异DNA甲基化下调位点有6785个,占比89%;827个上调的DNA甲基化位点,占比11%;差异DNA甲基化区域主要分布在基因间峰,有3648个,占比48%,其次是内含子峰,有2580个,占比34%,而启动子峰只有362个,占比5%,最少的是外显子峰,只有77个,占比1%。差异DNA甲基化基因分子功能主要与低密度脂蛋白/脂蛋白结合、维甲酸X受体结合及磷脂/磷脂酰丝氨酸结合密切相关;而差异甲基化基因主要与叶酸的生物合成、丙酸和花生四烯酸的代谢、糖胺聚糖的生物合成、p53信号通路密切相关。***甲基化m6A检测结果表明:与非脾虚证CRA相比,脾虚证CRA患者中有25个基因的RNA甲基化水平显著上调,64个基因的RNA甲基化水平显著下调;RNA甲基化基因的GO分析:差异甲基化基因主要与BMP受体、丝氨酸/苏氨酸激酶结合及乙酰胆碱受体结合、脂肪酸合酶活性、甘露糖转移酶活性及细胞骨架蛋白活性相关;KEGG分析结果表明差异RNA甲基化基因主要与糖胺聚糖合成、肝素和鞘脂类代谢、补体系统密切相关。4.蛋白乙酰化结果表明,与非脾虚证CRA相比,脾虚证CRA患者中显著上调的乙酰化肽段有18个,而显著下调的乙酰化肽段有17个。GO分析结果表明,脾虚证中差异乙酰化修饰蛋白质主要参与细胞过程、代谢过程以及结合和催化活性。而KEGG分析结果表明,差异乙酰化修饰蛋白质主要参与剪接体,吞噬体、TCA循环、脂肪酸降解等。5.四君子汤显著改善脾虚证CRA患者的脾虚证评分,下调抑癌基因RAD23B的DNA甲基化水平,上调促癌基因EPHA3的DNA甲基化水平。结论:1.脾虚证是CRA的主要流行证候,50岁以上是CRA的好发年龄,脾虚证评分与CRA患者年龄成正相关。2.脾虚证CRA患者肠组织存在DNA甲基化、RNA甲基化m6A修饰及蛋白乙酰化异常,脂质代谢、能量代谢、氨基酸代谢紊乱可能是脾虚证CRA患者主要的病理代谢表型。3.四君子汤下调抑癌基因RAD23B的DNA甲基化水平,上调促癌基因EPHA3的DNA甲基化水平,提示四君子汤在预防脾虚证CRA进展中具有潜在应用价值。

关键词： 血栓性疾病   二代测序   基因突变   个体化诊治  

摘要： 背景:遗传性易栓症因发病年龄主要涉及儿童及青壮年,静脉血栓发生部位往往在少见部位(如颅内静脉窦血栓、腹腔内深静脉血栓以及肺栓塞等),其所造成的严重性、危害性和后遗症不容忽视,已知遗传因素在静脉血栓栓塞症(VTE)的发病中起重要的决定作用,查阅相关文献发现目前国内对此领域研究仍相对薄弱,深入研究将有助于血栓性疾病的精准诊治及个体化管理,以往一代基因检测技术只能解释其中约5～10%的病因,近年二代测序技术的发展为遗传性易栓症的深入研究打开新的局面,目前关于我国尤其华南地区血栓性疾病患者的临床及分子遗传学特征的研究仍十分有限。目的:研究遗传性易栓症患者的临床特征及遗传相关因素,为遗传性易栓症研究累积资料,并探讨二代测序在易栓症诊断的应用。方法:收集40例经二代测序发现基因异常的血栓性疾病患者的临床资料及基因测序结果,对相关临床特征及基因异常进行分析。结果:1.一般资料及临床表现本研究纳入无血缘关系的血栓性疾病病例40例,中位发病年龄29.5岁(12-64岁),首次发病年龄≤50岁36例(90.0%),50岁以上的有4例(10.0%)。男性患者28例(70.0%),女性12例(30.0%),男女比例2.3:1,女性患者中位发病年龄29.5岁,均为育龄期(20-43岁)。40例患者可有或无明显发病诱因,15例(37.5%)患者发病时可识别1至2个血栓形成相关危险因素,其中7例(17.5%)患者因妊娠或分娩诱发,占女性患者的58.3%(7/12);其余诱因包括2例(5.0%)肿瘤相关(1例患者发病4年后确诊卵巢恶性肿瘤、1例患者发病同时确诊急性B细胞白血病)、1例(2.5%)抗磷脂综合征、4例(10.0%)长途飞行/久坐/制动、1例(2.5%)口服雌孕激素、2例(5.0%)静脉穿刺。25例(62.5%)患者发病时无明确诱因。40例患者均利用影像学检查明确诊断不同类型的血栓性疾病,临床可表现为从单纯的下肢静脉血栓形成到严重的多部位血栓。其中36例(90.0%)发生静脉血栓、3例(7.5%)发生动脉血栓(脑梗塞、心肌梗死、肾梗死、肢体动脉血栓),1例(2.5%)发生动静脉混合性(大脑中动脉、颈动脉、双下肢深静脉)血栓。首次发病时,40例患者中有29例(72.5%)在单个部位发生血栓,11例(27.5%)患者在2至4个部位同时发生血栓。25例(62.5%)患者首发表现为下肢DVT,其中7例(28.0%)合并肺栓塞;9例(22.5%)患者首发部位为颅内静脉窦血栓,其中2例合并脑出血;4例(10.0%)患者首发部位为腹腔内静脉血栓(包括肝静脉、门静脉、肠系膜静脉、脾静脉、肾静脉);2例(5.0%)患者首发部位为上肢深静脉。40例患者就诊时共计发生55次独立的血栓事件,每位患者平均发生1.35次,发生血栓事件从1次至4次,其中29例(72.5%)患者为单次血栓形成,11例(27.5%)患者为复发性血栓形成,其中9例(81.8%)为静脉系统血栓复发,2例(18.2%)为动脉血栓复发,复发率差异无统计学意义(p=0.600)。2.二代测序结果特点64例患者进行了出凝血相关基因panel的二代测序,40例(62.5%)患者检出至少1个基因变异,其中9例(14.1%)患者检出1个以上变异,24例患者未检出变异。40例患者共检出50个基因变异,涉及12个与出凝血疾病相关基因的40个基因位点,其中杂合变异占98.0%(49/50),纯合变异占2%(1/50)。在变异性质中,错义突变占74.0%(37/50),无义突变占12.0%(6/50),小片段缺失/重复突变占4.0%(2/50),移码突变占4.0%(2/50),剪切区变异占4%(2/50)。具体检出的50个基因变异中,SERPINC1、PROC、PROS1三种抗凝蛋白编码基因变异共占72%(36/50),检出THBD基因变异占6%(3/50),凝血因子编码基因变异共占12%(6/50),其中F2 G1787T检出1例,F5基因突变3例,分别为F5 c.1059C>G、c.1000A>G和c.5378G>T各1例,未检出Leiden突变;FGA、FGB基因突变各1例。组织型纤溶酶原激活物(t-PA)编码基因PLAT基因突变占4%(2/50)。其余检出COL3A1 c.3775G>A、CYP4V2c.802-8＿810delins GC变异各1例。本组患者中检出仅涉及单个基因单位点变异患者31例(77.5%),检出涉及2个或以上位点的复合基因变异有9例(22.5%),本组病例复合基因异常以抗凝蛋白复合缺陷或抗凝蛋白联合其他基因缺陷为主(78.9%,15/19)。50个基因变异中,依据ACMG分类指南,结合患者临床表型及家系等表现,本研究鉴定为致病或可疑致病性的基因变异占58%(29/50),鉴定为意义未明的基因

关键词： 母源突变体   条件性敲除   卵母细胞   大片段删除   rbm24a  

摘要： 母源因子是卵母细胞在成熟过程中积累的mRNA和蛋白质。其对于调控卵母细胞的成熟和胚胎的早期发育十分重要。在斑马鱼中,有超过一半的基因都有母源表达。斑马鱼的合子基因组激活起始于一千细胞期(受精后3小时),在这之前的所有发育过程完全由母源因子调控。即使合子基因组激活后,母源因子仍然会发挥作用,调控胚胎的下包,集中延伸运动,背腹轴的形成等。因此要想阐明一个存在母源表达的基因的功能,需要同时清除其母源和合子产物。基因的母源产物是在减数第一次分裂的双线期产生并积累的,此时同源染色体没有分离,因此只有纯合突变的雌性个体的后代才是母源突变体。一般情况下,通过遗传学的手段获得可活可育的纯合突变体是获得母源突变体的必要条件。但是传统的遗传学方法是通过一代代交配筛选获得纯合突变体的,这样不仅耗费时间(3代鱼,9个月),而且很多基因的纯合突变体不能存活或者不育。这给获得靶基因的母源突变体设置了障碍。目前,有多种方法试图绕开这一障碍,如注射mRNA拯救、生殖细胞替换手术、卵母细胞显微注射、镶嵌突变策略、BACK策略等。这些方法虽然都创新性地丰富了我们获得靶基因母源突变体的手段,但是它们或者效率低、耗时长,或者技术难度大,因此急需建立一种更加快速直接的方法来获取母源突变体。CRISPR-Cas9系统已经成为基因编辑领域广泛使用的一个强大工具,促进了很多生物学领域的研究。而基于CRISPR-Cas9的条件性敲除已经在多个物种中得到验证。其通常采用的策略是转基因特定启动子驱动的Cas9,从而实现时空特异性的靶基因敲除。然而,目前在斑马鱼中应用Cas9进行条件性敲除的报道并不是很多,其原因可能是效率不稳定导致的镶嵌现象。在大部分组织中所有细胞是作为一个整体在发挥作用,Cas9与sgRNA效率不稳定的结果是只有部分细胞完成了双等位基因的敲除,于是组织中的野生型或者杂合细胞可以对纯合突变细胞进行功能上的补偿,这样的动物模型就不会有明显的表型。但是卵母细胞与其他组织不同,进入双线期后相对独立,互相并不会进行功能上的补偿,一旦突变就会导致母源突变胚胎的产生。因此,在卵母细胞中利用Cas9进行条件性敲除仍然具有高度的可行性。利用这个思路我们开发了卵母细胞特异性条件敲除技术用于获得斑马鱼母源突变体。实现这一技术需要在卵母细胞中同时转基因表达Cas9和sgRNA。我们首先构建并验证了可以在卵母细胞中特异性高表达Cas9的转基因品系Tg(zpc:zcas9)。随后我们将高效的靶基因sgRNA序列连入U6启动子后面,并加上泛表达GFP的序列方便后期的筛选。最后利用I-Sce I转基因技术将构建好的sgRNA表达质粒插入Tg(zpc:zcas9)胚胎基因组中。挑选GFP表达广泛且强烈的胚胎饲养至性成熟。在这些F0雌鱼中,部分卵母细胞会同时表达Cas9和sgRNA,对靶基因进行母源敲除,产生母源突变体。我们首先对这一技术进行初步验证,通过向Tg(zpc:zcas9)品系中转基因表达单个nanogsgRNA,我们成功筛选出2个F0能够产下nanog母源突变体。nanog母源突变体的比例平均约占所有表达GFP胚胎的16.5%。接着我们将nanog sgRNA表达模块的数目增加到3个,进一步地将获得母源突变体平均效率提高到了 38.8%。通过检测,我们发现nanog的母源mRNA和蛋白明显缺失,下游靶基因的表达量明显下降且表达图式出现异常。不仅如此,我们发现向突变体中注射野生型nanog mRNA能显著地拯救其表型,这些结果均验证了我们得到的nanog母源突变体。为了能更准确地鉴定和研究母源突变体,我们建立了一套能同时检测胚胎表型和母源mRNA的方法。利用该方法我们不仅鉴定出了nanog母源突变体的母源mRNA突变形式,而且将这些突变形式与nanog母源突变体的表型一一对应了起来。在这过程中,我们发现卵母细胞中多个Cas9 RNP作用倾向于产生大片段删除。这些删除形式中不仅包含sgRNA位点间的删除,甚至还出现了两端越过sgRNA位点的删除,这一现象在斑马鱼中鲜有报道,但是与哺乳动物早期胚胎和胚胎干细胞中进行基因编辑所出现的“在靶效应”(On Target Effect,OnTE)有一定的相似性。为了进一步验证卵母细胞特异性条件敲除技术的可行性以及多个Cas9 RNP在卵母细胞中倾向于产生大片段删除的现象,我们利用3个不同sgRNA表达模块构建了ctnnb2的母源突变体。相似地,我们通过检测下游靶基因的表达以及回补野生型ctnnb2 mRNA验证了得到的ctnnb2母源突变体。同样地,我们发现了与nanog母源突变体类似的大片段删除现象。那么这一现象是卵母细胞独有的吗?为了作出比较,我们用同样的sgRNA组合与高浓度的Cas9蛋白进行常规的体细胞编辑。经过基因型鉴定与统计,我们发现对于

关键词： 脑性瘫痪   严重小头畸形   临床特征   分子遗传学   染色体微阵列分析   全外显子组测序  

摘要： 目的分析总结脑性瘫痪(简称脑瘫)合并严重小头畸形患儿的临床特点及分子遗传学特征,以期达到以下目的:明确脑瘫合并严重小头畸形患儿的临床特征,为制定合理的诊疗及康复管理方案提供依据;发现潜在的遗传学变异,筛选相关的致病性基因或位点,有助于脑瘫与小头畸形的发病机制研究,并为脑瘫合并严重小头畸形的遗传诊断及遗传咨询奠定基础。方法对前期调查的于成都市行政辖区各残疾人联合会登记的脑瘫患儿的流行病学资料进行提取,内容包括一般情况、体格测量数据、脑瘫的分型及功能分级、共患病情况等。根据头围对患儿进行分组,并比较严重小头畸形组与头围正常组、轻度小头畸形组患儿临床特征的差异。然后由小儿神经发育及康复专家团队对所有伴严重小头畸形的脑瘫患儿进行再次上门调查,采用问卷调查形式收集临床资料,并由高年资小儿神经科医生及康复专家进行体格检查,以分析病因。在排除存在继发性致病因素的患儿后,对病因不明的脑瘫合并严重小头畸形患儿经其家长知情同意后采集血样,采用染色体微阵列分析(chromosomal microarray,CMA)技术探索其全基因组水平的DNA拷贝数变异(copy number variation,CNV)情况,对照组采用的是Affymetrix提供的正常人DNA。对CMA检测阴性的脑瘫合并严重小头畸形患儿进行全外显子组测序(whole exome sequencing,WES),通过与数据库比对及生物信息学分析筛选与疾病相关的突变位点和(或)基因。结果一.脑瘫合并严重小头畸形患儿的临床特征1.1一般情况共提取422名脑瘫患儿的调查资料,其中265例(63%)头围正常,90例(21%)为严重小头畸形,58例(14%)为轻度小头畸形,9例(2%)合并大头畸形。严重小头畸形组的脑瘫患儿以女性为主(61%),平均年龄为6.6±3.3岁,足月儿占65%,该组患儿的性别分布、年龄及孕周与头围正常组、轻度小头畸形组均存在显著差别(p=0.001,p<0.001,p=0.003)。1.2脑瘫的临床分型严重小头畸形组的脑瘫分型以痉挛型四肢瘫为主(33%),其次是痉挛型双瘫(29%)、混合型(14%)、痉挛型偏瘫(13%)、不随意运动型(9%)和共济失调型(1%),而头围正常组、轻度小头畸形组的脑瘫分型均以痉挛型双瘫为主。1.3脑瘫的功能分级严重小头畸形组的粗大运动功能分级(gross motor function classification system,GMFCS)为II级25例(28%),III级19例(21%),IV级46例(51%);手功能分级(manual ability classification system,MACS)为II级22例(34%),III级20例(30%),IV级24例(37%)。合并严重小头畸形的患儿GMFCS和MACS等级均显著高于头围正常的脑瘫患儿(p值均<0.001)。1.4共患病严重小头畸形组的共患病由高到低依次为认知障碍(80%),交流障碍(66%),吞咽障碍(51%),癫痫(40%),视觉障碍(38%),行为异常(33%)及听觉障碍(3%)。仅10%无共患病,累计有2、3或4种共患病的患儿各占20%,累计有1、5或6种共患病的各占10%,尚有2%的患儿存在7种共患病。严重小头畸形组脑瘫儿的共患病发生率及累计共患病数均显著高于头围正常组及轻度小头畸形组(p值均<0.001)。1.5头围与疾病严重程度的相关性整体来看,头围Z分与GMFCS、MACS等级及累计共患病数均呈负相关(p=0.001,p=0.013,p<0.001)。在严重小头畸形组,头围Z分与MACS等级及累计共患病数均呈负相关(p=0.046,p=0.034)。二.脑瘫合并严重小头畸形患儿的DNA拷贝数变异分析2.1一般情况参与再次调查的86名脑瘫合并严重小头畸形患儿中,35名(41%)男性,51名(59%)女性。平均年龄为6.4±3.4岁。发现异常时的年龄为出生7月龄,平均为10.0±7.1月龄。共30名患儿考虑为继发因素致病,包括早产儿脑室周围白质损伤8例(27%)、颅内感染7例(23%)、新生儿缺氧缺血性脑病5例(17%)、宫内感染4例(13%)、颅内出血3例(10%)和颅脑外伤3例(10%)。2.2 CMA结果排除30例存在继发性病因的患儿后,共对56例病因不明的患儿进行CMA检测。在15名(27%)患儿检测到19个致病性CNV,在8名(14%)患儿中检测到9个不确定临床意义的CNV,剩余33名(59%)患儿CMA结果为阴性。致病性CNV中有11个位于已知综合征,剩余8个位于数据库尚未定义的疾病区域,包括13个缺失性CNV和6个重复性CNV。缺失片段最大的30.7Mb,最小的0.06Mb,平均大小为10.0Mb;重复片段最大的为47Mb,最小的1.9M