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关键词： 非共同性斜视   先天性颅神经支配异常性疾病   先天性眼外肌纤维化   Duane眼球后退综合征   Mobius综合征  

摘要： 斜视是指两眼不能同时注视目标,属眼外肌疾病,可分为共同性斜视和非共同性斜视两大类。非共同性斜视是指双眼出现眼位偏斜且同时伴有不同程度的眼球运动障碍的一类疾病。研究发现一些非共同性斜视表现出很强的家族性,先天性颅神经支配异常性疾病(CCDDS)和非共同性斜视紧密相关,并用来解释共同性斜视的遗传学机制,该病是由先天性颅神经核及其各自的颅神经发育异常引起的一组疾病,临床表现为相关肌肉运动或联动异常。本文就近年来对先天性颅神经支配异常性疾病的遗传学研究作一综述。

摘要： 在高校的教育中,思政教育是非常关键的一项内容,当前已经受到了广泛重视,为了提升思政教学的效果,课程思政建设成为一项必然选择。遗传学是高校生物专业中非常关键的一门课程,在其中融合思政教育内容,打造遗传学教学课程思政,能够给学生专业课的学习以及思政教育内容的学习提供极大的帮助。本文即立足于此,首先简述了课程思政的重要价值,其次分析了遗传学内容和思政教育的结合点,最后重点探讨了遗传学教学中课程思政的开展,以期能够为高校教育提供一些帮助。

关键词： 不孕不育   染色体核型分析   临床意义   外周血  

摘要： 目的:本次研究的目的是患研究不孕不育人群外周血淋巴细胞的核型分析以及临床上生殖的相关性.方法:本次研究于2018年1月至-2020年12月开展,研究对象为,在我院接受治疗的的1226例不良孕史以及患者的外周血淋巴细胞进行细胞培育、胰酶消化、吉姆萨染色后染色体核型分析.得出:男性异常率高于女性;者1226名患者中,常染色体结构出现特别变化的有6例,出现染色体特别变化的概率为8.22％;性染色体出现特别变化的有11例,异常率为15.07％;染色体多态性携带者55例,异常率为75.34％.结论:不孕不育者中染色体数目和结构异常也是造成生殖异常的重要原因之一,对不孕不育患者进行外周血细胞核型分析能帮助患者寻找病因,为临床治疗提供参考和依据.

关键词： 脑腱黄瘤病   CYP27A1   固醇-27-羟化酶   胆甾烷醇   胆固醇  

摘要： 目的:分析4例脑腱黄瘤病（Cerebrotendinous Xanthomatosis,CTX）患者的临床表型及基因型,并研究CYP27A1基因突变的临床意义。方法:收集和整理4例脑腱黄瘤病患者的临床资料,使用酚-氯仿法抽提CTX患者外周血DNA,对样本进行全外显子测序检测,通过聚合酶链式反应和Sanger测序对检测结果予以验证分析。通过外周血DNA的提取,运用单倍型分析法分析CYP27A1基因突变的意义。结合回顾分析既往报道的脑腱黄瘤病,研究CYP27A1基因突变的临床意义。结果:通过临床表型回顾和遗传学分析的方法,我们共确诊出4例脑腱黄瘤病患者,男性和女性患者均为2例。CTX的一般发病年龄为7～14岁,平均年龄为9.5岁,一般病程为17～25年,平均程为22年。我们研究的CTX患者主要以下肢无力、行走不稳及言语障碍为首发临床表现,体格检查发现双侧腱反射增强、Babinski征阳性,指鼻试验阳性,其中2例CTX患者伴有高弓足畸形。根据全外显子测序和Sanger测序验证显示:4例先证者都是两个CYP27A1基因变体的复合杂合子,包括c.1263+1G＞A（内含子7）剪接位点的1个突变。2个新的可能致病性突变（c.255+1G＞T和c.1561dupA）和3个既往报道过的致病性突变,包括c.379C＞T,c.1263+1G＞A和c.1537C＞T。SNP 显示 CYP27A1 基因在 c.1263+1G＞A 突变位点具有部分单倍型相同。结论:CTX是一种罕见的常染色体隐形遗传的脂质代谢疾病,本研究明确了 4个先证者为CTX患者,基因检测均为CYP27A1两种变体的复合杂合子,包括c.1263+1G＞A（内含子7）剪接位点突变,c.255+1G＞T和c.1561dupA两种新的可能致病性突变,以及c.379C＞T、c.1263+1G＞A和c.1537C＞T三种致病性突变。c.1263+1G＞A基因突变在我国报道的病例数量中很常见（7/25,28%）,因此可能是中国CTX患者CYP27A1基因突变的潜在热点。通过SNP单倍型分析得出c.1263+1G＞A基因突变位点具有临床致病意义。CTX的诊断通常根据临床表现、神经影像学、血生化检测和遗传分析确定。早期诊断CTX是尽早开始鹅去氧胆酸（Chenodeoxycholic acid,CDCA）治疗的关键,可有效逆转和预防相关临床症状的进展。图3 表5参88

关键词： 鲂属   遗传多样性   遗传结构   基因流   群体历史   食性  

摘要： 鲂属(Megalobrama)隶属于鲤形目(Cypriniformes),鲤科(Cyprinidae),鲌亚科(Culterinae),包含团头鲂(***)、三角鲂(***)、广东鲂(***)和厚颌鲂(***)4个物种,是我国分布较广泛的淡水经济鱼类。近年来受自然环境以及人为因素的影响,鲂属鱼类野生资源严重衰退,而有关鲂属鱼类种质资源保护和群体遗传学的研究甚少。随着高通量测序技术的发展,联合基因组学和群体遗传学不仅可获得物种群体遗传信息,同时有助于揭示物种多样性的形成及环境适应性机制。本研究利用X光透射照相法检测了鲂属鱼类的可量比例性状和可数性状,并对鲂属鱼类的形态学参数进行了比较和分析;扩增了鲂属鱼类的线粒体细胞色素b(Cytochrome b)和控制区(Control region)序列,分析了鲂属鱼类不同地理群体的多样性和遗传差异;以前期获得的团头鲂全基因组为参考,采用全基因组重测序方法建立鲂属鱼类群体基因组变异数据库,通过可信度较高的SNP信息探究了鲂属鱼类的群体结构、进化关系及种群演变历史,并利用选择清除分析发掘与鲂属鱼类食性差异相关的候选基因,进而揭示其环境适应性形成的机制。研究将阐明鲂属鱼类形态差异、遗传变异、群体结构及种群历史动态演变,揭示鲂属鱼类群体进化过程及对环境的适应性分子机制,为我国鲂属鱼类的种质资源保护提供科学依据。主要研究内容和结果如下:1.基于X光透射照相法的鲂属鱼类形态差异分析利用X光透射照相法共对鲂属4个物种的34项可量比例性状和12项可数性状进行了检测和分析。结果表明头长/体长、尾柄长/体长、2-4/体长、2-5/体长、4-5/体长和6-9/体长等可量比例性状在鲂属种间具有显著性差异(P<0.05)。主成分分析结果表明在主成分1中起关键作用的是与鱼体背腹轴相关的性状,主成分2中起关键作用的是与鱼体头尾轴相关的性状,而主成分3中起关键作用的是与鱼体游动相关的性状。多元统计分析结果揭示了广东鲂与其他三种鲂的亲缘关系最远,而三角鲂和厚颌鲂的亲缘关系最近。研究通过将传统人工测量方法和X光透射照相法的测量结果进行比较分析,发现鲂属可量性状指标的平均值在两种方法中的差异均较小,而T检验结果显示,共有17项可量比例性状在两种方法间有显著性差异,其中11项性状指标是传统手工检测明显大于X光照相法检测结果,研究推测这可能与鱼体表面具有一定的曲度有关。2.基于线粒体序列的鲂属鱼类群体遗传多样性和遗传分化通过对鲂属鱼类线粒体Cytb和CR序列进行扩增,研究发现鲂属鱼类不同群体共定义到了47个单倍型,广东鲂和三角鲂群体的单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(Pi)均较高。单倍型网络图结果表明团头鲂和广东鲂各形成一个单系群,三角鲂和厚颌鲂则聚为一枝。另外鲂属鱼类不同地理群体间均有较高水平的遗传分化,尤其是在不同物种间表现最为明显。而广东鲂与鲂属其他物种群体间的遗传差异度最大。单倍型Hap1和Hap25为团头鲂和三角鲂的共享单倍型,研究推测在这两个物种间可能存在基因渗入。通过对鲂属鱼类不同群体间的基因流(Nm)进行统计,结果发现团头鲂的梁子湖群体和三角鲂的金沙河群体间存在较高水平的基因交流。而错配分析结果揭示了大多数鲂属群体积累了很多低等频率的等位基因,而少数群体中则积累了较多中等频率的等位基因。3.基于全基因组重测序的鲂属鱼类群体遗传变异及遗传结构分析通过与团头鲂全基因组比对,统计出鲂属样本的变异位点,结果发现团头鲂、广东鲂、厚颌鲂和三角鲂的单核苷酸多态性(SNP)变异位点数目分别为16,235,392个、16,133,317个、6,825,670个、17,179,046个,这些位点的分布类型主要包括基因间区、内含子区、3’端非翻译区、5’端非翻译区、非同义突变和同义突变。插入缺失位点(In Del)的分布分别为:团头鲂3,737,686个、广东鲂4,097,403个、三角鲂1,649,876个、厚颌鲂4,006,423个。结构变异位点(SV)的分布分别为:团头鲂108,169个、广东鲂95,589个、厚颌鲂59,356个、三角鲂102,721个。而拷贝数变异位点(CNV)在鲂属四个物种中的分布依次为团头鲂39,777个、广东鲂27,854个、厚颌鲂20,665个、三角鲂35,930个。进化树结果显示三角鲂和厚颌鲂首先聚为一枝,接着与团头鲂聚,最后再与广东鲂聚。群体遗传结构分析表明鲂属鱼类可分为六个亚群,即团头鲂和厚颌鲂群体各为一个亚群,广东鲂群体分为海南和珠江流域两个亚群,三角鲂群体分为抚远和其他流域两个亚群。群体间的分化指数(Fst)显示广东鲂与鲂属其余三个物种之间均有较大程度的遗传分化,而三角鲂和厚颌鲂之间仅有中等程度的遗传分化。另外研究发现

关键词： 苏尼特羊   运动   RNA-seq   差异基因  

摘要： 苏尼特羊是内蒙古的地方良种羊,肉质鲜嫩。本研究以运动和圈养组苏尼特羊为试验对象,测定了两种条件下苏尼特羊的生长性能、屠宰性能、羊肉品质。采用转录组测序(RNA-seq)技术对两组羊背最长肌进行测序,对差异表达基因进行了筛选,并对差异基因参与的生理功能及代谢通路进行分析。本试验采用了气相色谱-气质联用技术,对苏尼特羊脂肪酸进行了测定,采用q RT-PCR技术对差异基因进行了验证。结果如下:(1)在生长性能、屠宰性能和肉品质方面:运动组体长、胴体深、屠宰率、剪切力显著高于圈养组(P<0.05);背膘厚、p H、IMF含量、红度值、黄度值和亮度值显著低于圈养组(P<0.05);在脂肪酸种类方面,运动组的背最长肌中,饱和脂肪酸中的月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸显著高于圈养组(P<0.05);单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸中的豆蔻油酸、油酸、反式亚油酸、花生酸、γ-亚麻酸、α-亚麻酸、花生三烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十四碳烯酸含量显著低于圈养组(P<0.05)。结果表明运动改变了苏尼特羊脂肪酸的组成,圈养组羊肉色泽、嫩度优于运动组。(2)运动和圈养苏尼特羊背最长肌RNA-seq分析,筛选得到了621个差异表达基因,其中385个基因为上调基因,236个基因为下调基因。经过GO功能注释和KEGG通路分析发现,差异基因参与脂类代谢、糖酵解代谢和能量代谢等生物过程和代谢通路,共得到了HK2、HKDC1、TPI1、PKM、PGK1、ACSF3、ACSL3、AKR1B1、GK、SCP2、PLIN1、LPIN1、DGAT2等13个与肉质性状相关的候选基因。(3)随机选取12个基因(PLIN1、ACSL3、SCP2、EIF4EBP1、SYNJ2、TPI1、PKM、SETD7、DHDH、AKR1B1、SDS、GOT1)进行q RT-PCR验证,12差异基因的表达结果与测序得到的表达结果一致,可以判断RNA-seq测序的结果准确,可靠有效。试验筛选了运动和圈养苏尼特羊背最长肌中的差异表达基因,获得差异表达基因参与的功能与代谢通路,脂类代谢、糖酵解代谢和能量代谢均与肉质相关,本研究可为苏尼特羊肉质进一步研究提供一定的参考。

关键词： 唾液酸沉积症   临床表现   遗传学特征   高通量测序  

摘要： 目的：　　唾液酸沉积症是一种罕见的常染色体隐性遗传的溶酶体疾病，其致病基因为NEU1。唾液酸沉积症根据其起病年龄及症状的严重程度可分为两型。与唾液酸沉积症Ⅱ型相比，唾液酸沉积症I型(sialidosis type I，ST-I)，起病较晚，症状轻，以进行性视力下降、眼底樱桃红斑、肌阵挛、小脑性共济失调、癫痫为主要特征。ST-I既往又被称为“樱桃红斑肌阵挛癫痫”，是进行性肌阵挛癫痫(progressive myoclonic epilepsy，PME)谱系疾病中的一种。目前全球报道的ST-I病例数不足百例，而中国大陆更是鲜有报道。　　进行性肌阵挛共济失调(progressive myoclonic ataxia，PMA)是一组以肌阵挛、小脑性共济失调为主要特征的临床综合征。肌阵挛和共济失调是许多神经系统疾病的共有表现。在临床实践中，针对其诸多的病因安排适当的检查，取得明确的病因学诊断十分困难，往往容易造成漏诊和误诊。由于PMA谱系下的疾病大多都是遗传因素导致的，今天我们更依赖于下一代测序(the nextgeneration ***)技术来明确诊断。然而，NGS是一种复杂的高通量测序技术，信息庞杂，每个步骤的处理都有可能导致数据丢失。　　本研究中，我们描述了从PMA患者和SCA患者中诊断出26例ST-I患者的经过，分析了NGS遗漏突变位点和临床早期误诊的原因，进一步对其临床及遗传学特征进行研究，以期加深临床医生对ST-1的认识。　　方法：　　1．纳入6个既往全外显子组测序阴性临床拟诊为PMA的家系，针对其中5个有近亲婚配背景的家系行全基因组SNP芯片扫描;通过纯合子定位技术及单倍型分析，结合疾病相关表型，定位家系可能的致病基因。　　2．采用Sanger测序在6个家系中对候选基因进行补充验证，并结合IntegrativeGenomics Viewer软件、比对记录、生信软件说明文档等分析NGS漏诊的原因;根据ACMG变异判读的标准和指南，结合序列保守性分析、SWISS-MODEL蛋白质结构预测，对新发突变进行致病性评估。　　3．纳入其他16位原因不明临床诊断为PMA的患者与202位原因不明临床诊断为SCA的患者（相关动态突变己筛查排除），利用Sanger测序和家系共分离分析，筛查NEU1基因突变;4．对确诊ST-1患者的临床资料进行分析总结，对早期误诊的原因进行分析。　　5．对确诊的26例ST-1患者及其家属进行单倍型的研究，并对NEU1基因c.544A＞G位点的突变年份进行推算。　　结果：　　***分析中潜在的漏洞：(1)人类基因组参考序列中的ALT contig人为地增加了基因组的重复序列，可造成包括NEU1基因在内的42个致病基因检测遗漏;(2)SAMtools软件中的默认参数L可导致平均深度大于250层的缺失变异被忽略。　　2．共有来自18个家系的26例患者被诊断为ST-1，占纳入PMA患者的75.0％(21/28)、SCA患者的2.5％(5/202);共检出3种突变位点，包括1个新发突变c.951—968delGGTAGCTGCAGGAGCTGT和2个己知突变(c.544A＞G．c.403G＞A)。　　3．不典型的临床表现：(1)癫痫在福建地区的ST-I患者中并不常见，仅占50％(13/26);(2)只有10％(2/20)的患者被观察到了眼底樱桃红斑;(3)共济失调是患者最常见的首发症状，其早期临床表现可与SCA患者相似;(4)肌阵挛和小脑性共济失调是福建地区ST-I患者最主要的临床表现。　　4．所有患者都携带有c.544A＞G突变，其中88.5％(23/26)的患者为c.544A＞G位点纯合突变，且在所有患者及家属中该突变与一单倍型紧密连锁，高度提示其存在奠基者效应。Gamma算法推导该突变发生在距今1160年，其95％的置信区间为(620，2220)年。在200名本地无血缘关系的正常对照中，我们筛查到了1例突变携带者;此外，Gnomad数据库中其在东亚地区的突变频率为0.001361(27/19832)。　　结论：　　1．在临床实践中，阳性的NGS检测结果能驱动我们对患者表型进行重新梳理，而阴性结果却往往使我们排除对这个基因的怀疑。面对阴性的NGS检测结果，我们应该多从以下几个方面进行思考：(1)对患者进行详细的临床评估以建立正确的鉴别诊断;(2)详细追问患者的家族史及遗传模式;(3)采用经典的遗传学定位手段对潜在的致病基因进行定位;(4)针对拟定的目标基因，对NGS结果进行手动的检查;(5)采用其他特异性的方法对目标基因进行检测，如Sanger测序、MLPA等，以弥补短读长测序技术的短板。　　2．与传统的PME分类不同，我们的患者以肌阵挛和小脑性共济失调为主要表现，仅部分伴有癫痫发作，无认

关键词： 光遗传学   光控心脏起搏   心律失常   视紫红质通道蛋白2   心肌细胞   非Langendorff法心肌细胞分离  

摘要： 目的:电刺激是人工控制心脏搏动频率的标准技术,但在实验研究中,这种方法有较大的局限性,如局部电解效应、刺激频率和时长受限、只能对目标范围内的所有细胞进行刺激、不能选择性作用于心肌细胞等。另一方面,实验研究需要获得心肌细胞,传统的心肌细胞分离技术多采用特殊的灌流装置进行逆行大血管灌流来分离心肌细胞,需要的设备要求精密,对分离心肌细胞技术要求过高,需要进行专业培训,有大量需要克服的技术问题,这严重阻碍了实验进程。本研究对基于光遗传学的光控心脏起搏技术进行了实验论证,并且探索了一种更简便易行的心肌分离技术的方法。这在心肌电生理学特别是心律失常研究中有着非常重要的应用价值。方法:1、杂交繁殖转基因小鼠:(1)研究使用的αMHC-Cre转基因小鼠为αMHC启动子驱动的心肌特异性Cre重组酶表达小鼠,ChR2(H134R)-td Tomato转基因小鼠在通用型CAG启动子和ChR2(H134R)-td Tomato融合基因之间插入了两个LoxP位点和STOP终止序列,在没有Cre重组酶的情况下ChR2(H134R)-tdTomato不表达。将两种转基因小鼠杂交后,在心肌细胞中表达的Cre重组酶对两个LoxP位点进行剪切和重组,中间的STOP序列被切除,ChR2(H134R)-tdTomato融合蛋白得以表达。将实验小鼠分为实验组αMHC-Cre/ChR2-tdTomato组(8-12周)和对照组:αMHC-Cre/ChR2-tdTomato(8-12周)、αMHC-Cre/ChR2-tdTomato(8-12周);(2)转基因小鼠基因型鉴定;(3)小鼠心脏荧光表型鉴定。2、采用特定频率的蓝光刺激使心肌细胞特异性表达光激活阳离子通道channelrhodopsin-2(Ch R2)的转基因小鼠心肌细胞膜电位去极化,从而引发动作电位并控制心脏搏动。3、用一种简便的无需Langendorff灌流的方法分离成年小鼠心肌细胞。结果:1、通过将αMHC-Cre小鼠和ChR2-tdTomato小鼠进行杂交,本研究获得了αMHC-Cre/ChR2-tdTomato(心肌特异性表达Cre和ChR2-tdTomato)、αMHC-Cre/ChR2-tdTomato(心肌特异性表达Cre但不携带ChR2-tdTomato基因)和αMHC-Cre/ChR2-tdTomato(不表达Cre,携带Ch R2-td Tomato基因但由于上游终止序列的存在而无法表达)三种基因型的小鼠。2、(1)转基因小鼠心脏荧光表型:在561 nm LED光源的激发下,αMHC-Cre/ChR2-tdTomato小鼠的心脏发出明亮的红色荧光且在其它部位没有荧光,说明ChR2-tdTomato融合蛋白在该基因型小鼠心脏中具有组织特异性的高水平的表达。在同样条件下,αMHC-Cre/ChR2-tdTomato小鼠心脏及其它部位均没有明显的荧光,说明ChR2-tdTomato没有表达。(2)心脏自主搏动小鼠的光控起搏心肌表达ChR2-tdTomato的αMHC-Cre/ChR2-tdTomato小鼠在连接呼吸机和开胸后,在没有蓝光刺激的情况下,心脏自主搏动的频率约为4 Hz;当给予小鼠心脏2 Hz的蓝光刺激时,原先的自主搏动节律被打乱,出现明显的心律失常;当蓝光刺激频率与自主搏动频率相同时,心跳频率维持在4 Hz;当使用6 Hz蓝光刺激频率时,心脏搏动完全由光照支配,且表现为窦性心律;当蓝光刺激频率提高至8Hz时,心跳频率也随之变为8 Hz,但出现了短暂的心律失常;当使用10Hz的蓝光刺激时,小鼠心肌已不能承受如此快速的去极化,虽然心脏搏动仍较为规律,但心电图波形已出现严重的紊乱。当蓝光刺激撤除之后,无论之前使用了何种刺激频率,小鼠心脏均可以迅速恢复到4 Hz的自主搏动状态。(3)心脏停跳小鼠的光控起搏为了检测因缺血损伤而无法自主搏动的心脏对蓝光刺激的反应,本研究将αMHC-Cre/ChR2-tdTomato小鼠麻醉后不连接呼吸机直接开胸,待心脏停跳后进行蓝光刺激,发现当刺激频率为1-5 Hz时,蓝光刺激可以有效引发小鼠心脏的搏动,搏动频率与刺激频率完全一致。当蓝光刺激频率更高时(7.5-10 Hz),由于可能存在的心肌损伤,小鼠心率仅能维持在4-5 Hz范围内,无法进一步提高。以上结果说明光遗传学技术具有起搏停跳心脏的能力,其起搏效果可能与心肌损伤的程度密切相关。(4)对照小鼠对蓝光刺激无响应:为了确认αMHC-Cre/ChR2-tdTomato小鼠心脏的光控起搏是由心肌表达的ChR2引发的,本研究还对αMHC-Cre/ChR2-tdTomato和αMHC-Cre/ChR2-tdTomato两种不表达ChR2-tdTomato的对照小鼠进行了同样的实验,发现两种小鼠对5 Hz和10Hz的

关键词： 梅花鹿   鹿茸   转录组学   蛋白质组学   代谢组学  

摘要： 鹿茸是一种能够完全再生的骨质器官,为雄性鹿科动物第二性征。鹿茸生长周期在100天左右,呈“S”型生长,最快生长速度可达2.75 cm/d或300 g/d。鹿茸细胞的增值速率比癌细胞快30倍,但有序、可控,是研究骨快速生长、骨质疏松的良好模型。目前针对鹿茸生长机制的研究主要是利用单一组学,如转录组学、蛋白质组学等。生长调控是一个复杂的生物学过程,对其进行全面的分析才能有助于探究其生长调控机制。本研究选取了6个不同生长阶段(15天、25天、45天、65天、100天与130天)梅花鹿鹿茸,分别取其茸尖(Antler Tip)、茸中(Antler Middle)、茸基(Antler Base)做为试验样本,利用多组学技术手段(转录组、蛋白组、代谢物)对梅花鹿鹿茸生长周期内的m RNA、蛋白质及小分子代谢物进行分析,挖掘鹿茸快速生长发育、骨化关键调控因子及信号通路。主要研究结果如下: 1.利用三代转录组学技术与二代转录组学技术相结合的方式构建了不同生长时期梅花鹿鹿茸的转录组表达图谱,共包含30227种基因,其中8778种为新功能基因转录本。对任意两个时期样品筛选差异表达基因,共获得14765种显著差异表达基因。通过对差异基因的表达模式分析发现,茸尖、茸中、茸基三个区段在生长发育过程中其基因表达变化不是同步的,其中茸尖的主要变化发生在65天～100天内,茸中发生在45天～65天,茸基发生在25天～45天。进一步分析发现软骨发育相关基因在生长期茸尖(25、45、65天)表达上调;成骨细胞分化等相关基因在骨化期茸尖(100、130天)表达下调;视黄醇代谢相关基因在骨化期茸尖(100、130天)表达上调;破骨细胞分化、骨基质降解等相关基因在茸中与茸基表达上调。 2.利用label-free定量蛋白质组学技术构建了不同生长时期梅花鹿鹿茸蛋白质表达图谱,包含3426种蛋白质,其中梅花鹿鹿茸核心蛋白185种。与肋软骨、股骨蛋白质对比,筛选到梅花鹿鹿茸特异性蛋白3种(CD5 antigen-like、Alpha-fetoprotein、LAMP2)。利用WGCNA分析方法筛选鹿茸时期特征模块蛋白,其中生长期茸尖特征模块包含330种蛋白质,参与了细胞增殖、软骨细胞分化等生物学过程;骨化期茸尖特征模块包含31种蛋白质,主要为溶酶体组分、丝氨酸蛋白酶抑制剂及脂代谢相关蛋白。茸尖、茸中、茸基三个区段在6个生长时期分别筛选到875种、787种、715种显著差异表达蛋白质。进一步分析发现在生长期茸尖(15、25、45、65天),软骨发育相关蛋白表达上调,而骨基质吸收、免疫反应等相关蛋白表达下调。利用PRM靶向蛋白质组学技术对7种显著差异蛋白进行验证,结果显示两种蛋白质组学技术相对定量结果基本一致,而且PRM的检测灵敏度更高。 3.利用UHPLC-TOF-MS非靶向代谢组学技术构建了不同生长时期梅花鹿鹿茸小分子代谢物表达图谱,共包含253种显著差异代谢物(VIP>1,p<0.05)。通过对差异代谢物相对含量分析发现,在鹿茸生长发育过程中变化最显著的代谢通路为氨基酸代谢与三羧酸循环,且在鹿茸生长期上调;而组胺、前列腺素等化合物在鹿茸骨化期表达上调。 4.转录组与蛋白质组共关联到2890种蛋白质,且主要为高丰度表达基因,而低丰度表达基因未在蛋白质水平鉴定。茸尖、茸中、茸基分别关联到486种、461种、44种关联差异基因/蛋白,相关系数分别为0.73、0.246、0.16。对转录组与蛋白质组数据进行整合,不同生长时期茸尖、茸中、茸基差异表达基因分别为6622种、7794种、1240种。联合转录组学、蛋白质组学、代谢组学筛选到鹿茸快速生长相关因子11种,分别为GDF5、SOX9、SOX6、COL2A1、COL9A1、COL9A2、COL9A3、COL11A1、COL11A2、ACAN、HAPLN1;鹿茸快速骨化相关因子9种,分别为AR、CYP19A1、Hsd17b1、HSD17B2、HSD17B3、HSD17B7、HSD17B10、HSD17B14、SRD5A1。Wnt16是鹿茸生长发育过程中变化最显著的wnt家族蛋白,且在骨化期茸尖表达上调,推测wnt16所介导的wnt信号通路可能参与了鹿茸的快速骨化过程。 综上所述,我们基于多组学联合分析技术构建了梅花鹿不同生长时期、不同区段的基因、蛋白质、小分子代谢物表达图谱,并筛选到梅花鹿鹿茸快速生长与骨化的关键因子,为鹿茸快速生长与骨化的分子调控机制的解析奠定基础,同时为以鹿茸为基源的药品、保健品的研发及高产茸用新品种培育提供基础数据支撑。

关键词： 恶性疟原虫   青蒿素抗性   k13基因   药物选择压   微卫星标记   选择性清除   抗性分子标记   遗传背景  

摘要： 疟疾是全球危害最严重的传染病之一,其病原体是疟原虫。恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)是寄生于人体的五种疟原虫之一,其引发的恶性疟发病较急、症状较为严重,甚至导致死亡。非洲是最严重的疟疾流行区,我国目前无疟疾本地感染病例。但近年来随着社会经济的发展,日趋频繁的国际间交流和贸易往来,由非洲输入我国的恶性疟病例居高不下,因此加强对非洲恶性疟原虫药物抗性的监测对我国疟疾防控工作具有重大意义。自2006年开始,WHO推荐全球以青蒿素为基础的联合用药(Artemisinin-based combination therapies,ACTs)作为一线抗疟药物来治疗恶性疟,ACTs的使用显著降低了疟疾发病率和死亡率。但是在2008年东南亚地区出现了青蒿素抗性虫株,目前已发展成东南亚地区严重的公共卫生问题。目前虽然非洲恶性疟原虫对青蒿素耐药的相关证据甚少,且以青蒿素为基础的一线复方药物对治疗非重症恶性疟仍然非常有效,但是非洲疟疾的高发病率和高死亡率,抗药性虫株可能成为疟疾防控工作最大的威胁,因此青蒿素耐药性监测至关重要。2014年,研究发现青蒿素抗性与K13-propeller(k13)基因有关,成为青蒿素抗性的分子标记用来监测青蒿素耐药性。本研究以来自非洲36个国家的1561份输入性恶性疟病例样本为研究对象,对青蒿素抗性分子标记k13基因进行多态性及药物选择压力分析,进一步通过微卫星标记分析选择性清除和种群遗传结构,还对可能出现药物选择压的地区的虫株进行遗传背景研究,为输入性恶性疟的临床合理用药提供科学依据,为监测青蒿素耐药恶性疟原虫的扩散提供参考。本研究内容分为三个部分:第一部分非洲输入恶性疟原虫青蒿素抗性标记分子k13突变分析目的:了解非洲输入恶性疟原虫青蒿素抗性分子标记k13基因的突变情况,并进行药物选择压力分析。方法:收集江苏省2011-2019年输入性恶性疟患者血样,对恶性疟原虫k13基因的Kelch螺旋桨域进行PCR扩增并测序。应用DNAstar软件对所有双向测序序列依据峰图进行编辑和校对,用Bio Edit软件将样本序列与参考序列进行比对,应用Dna SP软件分析k13基因序列多态性及进行中性检验,应用MEGA软件计算非同义碱基替代率(d N)和同义碱基替代率(d S)。利用SPSS22.0软件进行数据的统计分析,计算各位点及不同地区、年份之间的k13突变率。结果:来自36个非洲国家的1561份输入性恶性疟样本的k13基因有89份共54个位点发生了突变,非同义突变有35个,同义突变有19个。在来自非洲中部地区的17份样本中检测出与青蒿素抗性相关的突变位点(M476I、A481V、G533A、G533S、N537I、I543T、M579I、M579V、C580Y、P667S、F673I),15例来自赤道几内亚,1例(C580Y)来自加蓬,1例(M579V)来自喀麦隆。来自非洲中部特别是赤道几内亚的样本k13基因非同义突变率及多态性水平均明显高于其他地区,d N/d S比值为3.187。各年份之间突变率的差异无统计学意义。结论:非洲大部分地区恶性疟原中k13基因呈多位点低频率突变,赤道几内亚恶性疟原虫k13基因的突变频率明显高于其他地区,发现多个可能跟青蒿素抗性相关的突变位点,而且d N/d S比值为3.187,可能受到药物选择压影响。第二部分非洲输入恶性疟原虫k13基因侧翼微卫星多态性分析目的:比较非洲各地区非同义突变株与野生株之间微卫星位点期望杂合度的差异,进一步分析恶性疟原虫k13基因是否受到选择性清除的影响。方法:对k13基因侧翼的10个微卫星位点进行分析,应用Gen Al Ex软件计算各群体的期望杂合度(Expected heterozygosity,He),并检验各群体之间He值的差异有无统计学意义,判定是否存在选择性清除。用Arlequin软件分析计算遗传分化系数Fst值,并应用Structure软件分析恶性疟原虫遗传结构。结果:恶性疟原虫五个微卫星位点平均等位基因个数为16.7,He平均值是0.831。对不同地理区域(非洲中部、非洲南部、非洲西部)以及样本来源比较多的国家(赤道几内亚、安哥拉、尼日利亚)的He比较分析,差异未发现具有统计学意义(P>0.05)。将样本按照是否突变(非同义突变株和野生株)和是否具有青蒿素k13抗性相关突变位点(青蒿素抗性相关突变株和野生株)进行分类,比较两者He,差异也不具有统计学意义(P>0.05)。对非洲中部及赤道几内亚、非洲南部及安哥拉、非洲西部的非同义突变株和野生株进行He分析,差异同样无统计学意义(P>0.05)。遗传结构分析显示非洲西部与非洲南部的遗传分化系数Fst值最大为0.028(P<0.05)。在不同国家之间安哥拉和尼日利亚Fst值最大为0.04