关键词：
脊髓损伤
光遗传学
初级运动皮层
谷氨酸能神经元
运动功能
摘要：
到目前为止,脊髓损伤（Spinal Cord Injury,SCI）仍然是神经科学研究中的难点,它是全球致残的主要原因之一。前期有临床试验证实运动皮层兴奋性增高与脊髓损伤患者的功能预后明显相关。然而,运动皮层的何种细胞类型导致了后期的功能恢复以及恢复的神经机制尚不清楚。本研究我们使用光遗传学技术靶向激活初级运动皮层（M1区）中的谷氨酸能神经元,并研究激活初级运动皮层中的谷氨酸神经元是否能促进大鼠脊髓损伤后的功能恢复及其涉及到的初步神经机制。结果表明,运动皮层中谷氨酸能神经元的靶向激活可以显着改善大鼠的运动功能评分。并且能有效缩短运动诱发电位的潜伏期和提高运动电位振幅。此外,在损伤处的HE（Hematoxylin-eosin,HE）染色和神经纤维（Nerve Filament,NF）染色显示精确激活初级运动皮层能有效促进脊髓损伤处的组织恢复和神经丝（GAP-43、NF）的生长,并且损伤处的一些生长相关蛋白（BDNF、NGF）含量有所增加。这些结果表明,初级运动皮层中谷氨酸神经元的选择性激活可以促进脊髓损伤后的功能恢复,并且可能对理解刺激运动皮层提高运动功能恢复的神经细胞机制具有一定的意义。目的:研究光遗传学激活脊髓损伤大鼠的M1区谷氨酸能神经元对脊髓损伤大鼠的运动功能恢复的影响,并探究其机制。方法:1.随机将90只SD大鼠,雌性（由于雌性大鼠相比于雄性大鼠更方便后期脊髓损伤后的人工排尿和护理,故选择雌鼠）,分为4组:光刺激组（SCI+Ch R2）、假刺激组（SCI+m Cherry）、单纯脊髓损伤组（SCI）和假手术组（Sham）。我们采用的是钳夹法来制备大鼠的不完全脊髓损伤模型,并且在建模后的第一天,通过检测脊髓损伤大鼠的运动诱发电位（Motor Evoked Potential,MEP）（观察其潜伏期和振幅）的波形来确定建模是否成功（如果造模后第一天的运动诱发电位的波幅几乎为一条直线,则表示造模成功）。单纯脊髓损伤组（SCI）仅将脊髓夹闭,假手术组（Sham）仅仅切开对应节段的皮肤并用咬骨钳咬开椎板,不作任何干预;其中假刺激组（SCI+m Cherry）注射病毒为“AAVCa MKⅡα-m Cherry”,该病毒包含的Ca MKⅡα基因启动子序列能够准确的表达在谷氨酸能神经元内,但由于它不含光通道蛋白基因,所以在473nm的蓝光刺激时不可以把M1区的受该病毒成功转染的谷氨酸能神经元激活。相反,光刺激组（SCI+Ch R2）注射病毒为“AAV-Ca MKⅡα-Ch R2-m Cherry”,因为其包含了Ca MKⅡα基因启动子序列和光通道蛋白基因,所以在光刺激后可以精确地感染谷氨酸能的神经元并被相应的蓝光激活。待到病毒注射成功后,病毒在注射的M1区表达后（约注射病毒后3周作用）,采用免疫荧光法对注射病毒的大脑区域进行切片DAPI染色和c-Fos染色,并且用全玻片扫描进行观察。由此来确认病毒注射位点和注射量是否足以引起相应的反应。2.病毒表达后进行造模操作,剥开T10的椎板,使用50g动脉瘤夹压迫T10脊髓60s,在此期间伴有尾摇和后肢反射,提示脊髓损伤模型成功。此外,为检测造模是否成功,建立脊髓损伤模型后的第一天,对受伤的大鼠进行运动诱发电位（Motor Evoked Potential,MEP）测试,以查看振幅和潜伏期是否与截瘫的波形特征一致。3.光刺激组和假刺激组的大鼠于造模成功后第3—14天进行473nm蓝光刺激,每日2次,共刺激2周。单纯脊髓损伤组做常规的人工排尿工作,假手术组在笼中喂养,此外不做任何操作,直到实验结束。4.光刺激完成（脊髓损伤造模后2周）后,最后一次光刺激后90分钟内（此时注射的病毒经光刺激后大量表达）行心脏灌注术,并且将脊髓剥离出来,将损伤处的前后1cm处切下冷冻于-80℃冰箱中,使用WB检测各组大鼠脊髓损伤处的生长相关蛋白（43-KDa Growth-associated Protein,GAP-43）、脑源性神经营养因子（Brain-Derived Neurotrophic Factor,BDNF）和神经生长因子（Nerve Grouth Factor,NGF）的蛋白表达情况。5.采用BBB（Basso,Beattie,and Bresnahan,BBB）评分和斜坡实验在脊髓损伤后1—6周时每周评价脊髓损伤大鼠的运动功能。6.在脊髓损伤后第6周时,灌注取每组大鼠的脊髓组织进行HE染色和神经纤维丝（Nerve Filament,NF）的免疫荧光染色,观察受伤部位的脊髓修复情况。另外,在每组大鼠中再次测量运动诱发的电位,以观察振幅和潜伏期的变化。结果:1.M1区谷氨酸能神经元的激活大鼠注射腺相关病毒3周后,通过DAPI染色,显示该病毒在双侧M1区有明显且稳定的表达,并且通过对大脑的c-Fos染色也显
