关键词：
X射线激发光遗传学
X射线激发发光纳米颗粒
光遗传学
发光效率
摘要：
背景光遗传学技术是近十年迅速发展的一项应用于神经科学领域研究的新兴热门技术,这项技术集合了光学和遗传学的优势,利用可见光来刺激表达于神经元细胞膜上的光敏蛋白,进一步引起神经元的电活动,实现单个神经元的激活与膜电位测量,神经组织功能的实现与抑制,甚至是动物行为的即时改变,且具有毫秒级的时间精度和细胞层面的空间精度,因此它的出现大大拓展了研究的方法与视野,在神经科学领域发展史上具有里程碑式的意义。然而,由于光在生物组织中穿透深度的限制,在向特定的神经组织引入光照刺激的操作中,实验往往需要在动物脑部植入、固定并连接光纤接收终端或LED光源,这将对动物神经组织造成极大的机械损伤,设备的留置亦会导致慢性炎症的产生,极大影响并限制了该技术在基础、临床研究中的应用。使用在生物组织中具有高准直性与高穿透性的光源（如X射线）是替代传统光引入导致创伤过大的有效途径,然而X射线难以直接激发光敏蛋白,进行光遗传学研究。近年来,稀土元素掺杂的可发光纳米颗粒在生物医学领域中的研究与应用愈发成熟,这类纳米颗粒材料具有发光强而可控、化学性质稳定、生物相容性优良的特点,并且可被X射线激发而发出特定波长的荧光,通过与X射线结合使用,有望实现低创伤的X射线激发光遗传学。本论文拟在X射线激发发光稀土掺杂纳米颗粒研究基础上,采用X射线作为激发光源,将纳米体系作为X射线到可见光的能量转换单元,激发神经元细胞膜上的光敏蛋白,从而激活或抑制神经元,实现光遗传过程,并通过体内实现,对X射线激发光遗传学可行性进行研究。目的1.研发出形貌均匀、粒径合适、发光效率高的可应用于光遗传学的纳米颗粒。2.通过化学方法对纳米颗粒进行表面修饰,提高发光能力和生物体应用中的安全性。3.基于光谱匹配度好、发光效率高且生物安全性优良的X射线激发发光纳米颗粒开展光遗传学在体实验,研究X射线激发光遗传学的可行性。方法1.采用油热法和热分解法合成纳米颗粒Na Lu F:15%Tb,对比颗粒的理化与光学特性,确定较优的纳米颗粒合成方法。2.通过Gd掺杂、同质包壳和发光核心双掺杂等不同方法调控纳米颗粒的理化和光学性质,以获得发光效率高、发光强度足够、尺寸分布均匀、形貌单一可控的纳米颗粒,同时拓展纳米颗粒与光敏蛋白间光谱适配的组合。3.利用不同方法（如配体交换、无配体合成法等）对纳米颗粒进行水溶性修饰,通过纳米颗粒的水中分散性强弱、发光强度和生物安全性确定较优的生物安全性修饰方案。4.基于C57小鼠在体神经元c-Fos荧光染色实验,应用合适的X射线激发纳米颗粒发光刺激光敏蛋白,观察神经元激活情况,探索X射线激发光遗传学的可行性。5.基于C57小鼠运动行为实验,开展X射线激发光遗传学在体研究,结合同一实验体传统光遗传实验,对比动物运动行为的改变,探讨X射线激发光遗传学的可行性。结果1.热分解法合成纳米颗粒步骤简便,但发光效率极低,形貌各异,粒径不均匀。采用油热法合成的纳米颗粒发光效率高,形貌更为统一,粒径分布更为均匀,虽然尺寸偏大但可通过掺杂Gd减小粒径。因此采用油热法进行后续的纳米颗粒的制备。***的掺杂可明显改变以Na Lu F为基质的纳米颗粒的性质。Gd的浓度较低时颗粒为均匀的六角形,当浓度大于20%时纳米颗粒外部形貌逐渐变圆。随着Gd掺杂浓度的提升,纳米颗粒粒径和发光强度单调降低。当浓度为15%时,纳米颗粒最符合生物医学领域的应用。3.限定核心与外壳的稀土元素摩尔量比例在1:1范围内进行同质包壳研究,随着外壳的生长,纳米颗粒发光效率单调提升,当比例小于1:0.25时发光提升主要是因为减少了纳米颗粒表面缺陷,比例大于1:0.25且小于1:1时发光提升主要是因为纳米颗粒粒径的增长,增加了纳米颗粒对X射线能量的吸收效率。***与Eu共掺杂时存在能量传递现象,随着二者掺杂浓度的改变,纳米颗粒的发光性质亦相应改变,当二者的掺杂浓度分别为15%与9%时,纳米颗粒在橙、红光区域的发光强度最高。5.配体交换法中利用PAA修饰的纳米颗粒发光强度最好,通过无配体合成法利用盐酸修饰的纳米颗粒水中分散性最佳,但发光强度弱于前者,约降低20%。所有方法修饰的纳米颗粒都对离体培养的神经元没有明显的细胞毒性,具有良好的生物安全性。6.在在体神经元c-Fos荧光染色系列实验中,对C57小鼠单侧M2脑区进行实验处理,观察到实验组脑片的实验处理侧神经元激活比例明显高于对照组脑片的实验处理侧,实验组脑片的实验处理侧神经元激活比例亦明显高于实验组对侧未经病毒与颗粒处理的相同脑区。7.在动物运动行为的实验中,使用光遗传病毒和纳米颗粒处理小鼠单侧M2脑区,发现给予光刺激处理期间小鼠整体运动距离明显增加,但给予X射线刺激处理期间,小鼠的运动距离虽有改变但不具有统计学意义。值得注意的是部分实验体在给射线处理期间具有运动增加的趋势。结论1.确定了纳
