关键词：
纳米二氧化硅
食品级
DNA甲基化
肝毒性
潜在致癌风险
摘要：
随着纳米材料被大量运用于食品工业中,它对人类健康的潜在风险引起了相关政府部门和科学界的高度关注。其中,纳米二氧化硅作为应用最为广泛的食品添加剂,其生物安全性不容忽视。但是目前对于食品级纳米二氧化硅的生物安全性研究还十分匮乏,仅有个别文献基于常规毒理学的方法探究了食品级纳米二氧化硅在体内外的潜在毒性。但是由于现有评价手段的适用性存在很大的不确定性,因此亟需运用新兴的科学技术手段全面评估食品中纳米二氧化硅的潜在风险。课题组前期研究发现纳米材料在无明显细胞毒作用下,仍能引起基因组DNA甲基化的改变,表明纳米材料的安全性研究中需重点关注其表观遗传毒性。因此,本文以两种不同制备工艺的食品级纳米二氧化硅为研究对象,通过理化性质表征、常规毒理学检测和全基因组甲基化测序等方法,着重研究了随暴露时间、剂量变化的纳米二氧化硅体内安全性及潜在的靶器官表观遗传毒性,初步揭示在亚急性和亚慢性连续暴露下食品级纳米二氧化硅的潜在毒性,为全面认识食品级纳米二氧化硅的生物安全性提供了数据支撑。本论文的主要研究内容及结论如下:1.理化性质表征:首先,选择两种不同制备工艺的食品级无定型纳米二氧化硅（Synthetic amorphous silica,SAS）为研究对象,即化学沉淀法制得的S200和气相合成法制得的A200F,采用扫描电镜（Scanning electron microscope,SEM）对两者进行了形态与粒径的表征。结果发现,S200和A200F的初始粒径均在10-30nm之间。其次,采用动态光散射法检测了两种食品级SAS在水和人工体液中的水合粒径、zeta电位和多分散系数。结果显示:两种食品级SAS在水、人工唾液、人工胃液和人工肠液中水合粒径均明显增加,为初始粒径的数十倍;并且,两种食品级SAS在各种人工体液中的zeta电位绝对值均小于30 m V,提示分散体系较不稳定;其中,两种食品级SAS在人工胃液中的团聚现象均最为明显,表明生物体液的p H值及物质组成会影响食品级SAS在分散体系中的物理化学性质。最后,采用食品级纳米二氧化硅预混饲料,在体外模拟体内消化过程的实验中发现,两种食品级纳米二氧化硅饲料在经过唾液、胃液和肠液消化后均存在纳米级颗粒,特别是与唾液和胃液消化阶段相比,在肠液消化阶段有更多的纳米级二氧化硅颗粒出现,表明可能有更多的纳米二氧化硅颗粒跨过小肠上皮细胞,进入血液循环,从而被分布到其他组织脏器中产生潜在风险。2.食品级纳米二氧化硅在小鼠模型中的毒性研究:本文建立了食品级SAS亚急性（28天）和亚慢性（84天）连续暴露的小鼠模型,采用常规毒理学分析、全基因组甲基化水平检测、DNA甲基化元件和转座因子表达水平分析等实验对两种食品级SAS低、中、高剂量暴露后的生物安全性进行了研究。结果发现,在亚急性模型中,常规毒理学研究结果仅显示中、高剂量S200或A200F作用下的肝组织出现脂肪变性;但是,在表观遗传学水平上,小鼠外周血白细胞或肝脏中全基因组的5-m C和5-hm C水平发生了剂量和二氧化硅类型依赖的变化,尤其在SAS低剂量暴露时,一般毒理学指标包括ALT和组织病理学没有发生明显变化,但已产生了表观遗传毒性。而在亚慢性模型中,与对照组相比,两种不同剂量的SAS处理后小鼠的肝脏系数显著下降,S200高剂量组小鼠血浆ALT水平显著升高;同时,肝组织病理分析表明不同剂量的SAS均能引起小鼠肝脂肪变性,S200高剂量组小鼠肝组织出现了肝细胞坏死及大量炎症细胞浸润的现象,而中、高剂量A200F暴露后也能导致大量肝细胞脂肪变性且偶见气球样变性;主要组织分布结果显示,与对照组相比,S200不同剂量和A200F高剂量暴露后在小鼠肝脏均发生了显著蓄积;表观遗传学研究结果发现,与对照组相比,两种SAS作用下小鼠外周血白细胞中全基因组5-m C水平和肝脏的全基因组5-hmc水平均有显著的变化,而且肝脏的散在重复元件的表达水平也都显著下降。综上,肝脏可能是这两种食品级SAS的毒性靶器官,且毒性作用具有剂量、时间和二氧化硅类型依赖性。3.基于全基因组甲基化测序的食品级纳米二氧化硅潜在肝毒性及其机制研究:由于两种SAS在亚慢性高剂量暴露后均具有明显的表观遗传毒性,且肝脏是其靶器官,因此,本章进一步采用全基因组甲基化测序技术对两种SAS在该暴露条件下的肝毒性及其机制进行了研究。首先,评估了在m CG、m CHG和m CHH背景下,两种SAS暴露84天后肝脏所有染色体上的甲基化水平。结果显示,在m CG背景下,与对照组相比,两种SAS处理后影响了部分染色体的甲基化水平;而在m CHG和m CHH背景下,S200暴露后的肝组织1到19条染色体总体甲基化水平均明显低于对照组。进一步研究发现,在m CG背景下,S200暴露明显增加了上、下游5 kb和转录起始位点区域的甲
