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关键词： 脑出血   化学遗传学   谷氨酸能神经元   运动皮层   神经功能恢复   线粒体功能   海马DG区   细胞增殖  

摘要： 全球每年大约有200万人罹患自发性脑内出血(spontaneous cerebral hemorrhage,ICH),具有死亡率和致残率高的特点,并且目前治疗措施效果不佳。因此,寻找脑出血治疗的新策略和新靶点具有重要的科学意义和临床价值。所谓化学遗传学技术(designer receptors exclusively activated by designer drugs,DREADDs),是利用遗传学方法,利用化学小分子作为工具解决生物的问题,或者通过干扰、调控正常生理过程,以达到了解蛋白质功能,是利用化学工具进行探索和研究生命过程的一门新兴学科。相关研究表明,刺激大脑皮层可能会促进脑卒中的康复,但是相关的机制目前尚不明确,在本文中,我们将利用腺相关病毒转染使小鼠运动皮层表达hM3D(Gq),并结合腹腔注射氯氮平-N-氧化物(CNO),进而特异性激活运动皮层中的谷氨酸能神经元,探讨运动皮层的谷氨酸能神经元在脑出血小鼠的恢复过程中的作用及可能机制。本论文开展的研究如下:首先,本文将能够靶向谷氨酸能神经元的腺相关病毒载体,利用立体定向技术构建化学遗传学小鼠动物模型。饲养3周待病毒载体稳定表达后,给予氯氮平-N-氧化物(CNO)腹腔注射以实现对动物皮层谷氨酸能神经元活性的调节。选取部分模型动物灌注、取材进行免疫荧光检测,验证化学遗传学病毒载体的神经元表达情况,并通过免疫组化技术检测模型动物中标识细胞激活的即早基因c-Fos基因的表达情况,以验证谷氨酸能神经元的化学遗传学激活。随后通过尾动脉血纹状体立体定向注射构建小鼠脑出血动物模型,并对模型的稳定性和成功率进行评估。表明大脑皮层靶向注射腺相关病毒包装的hM3Dq-mCherry工具联合腹腔注射氯氮平-N-氧化物能够化学遗传学激活皮层谷氨酸能神经元;同时,本研究通过自体尾动脉血定向纹状体注射建立的小鼠脑出血模型具有模型成功率高、小鼠存活率高、血肿体积相对固定、组内差异小的特点,能够良好地用于开展脑出血相关研究。进一步,对于化学遗传技术激活皮层谷氨酸能神经元脑出血小鼠,我们通过Longa神经缺失量表评估小鼠神经功能,利用Grip tese、悬吊实验和Rotating beam实验评估小鼠运动感觉功能的恢复情况。并利用Morris水迷宫实验评估小鼠认知功能的恢复情况。实验表明化学遗传学技术激活运动皮层谷氨酸能神经元可促进脑出血后整体神经状态、运动感觉功能、协调性和运动耐力的恢复,并促进脑出血导致的小鼠空间学习和记忆功能损害的恢复。为了更深入探讨化学遗传学技术激活皮层谷氨酸能神经元改善脑出血小鼠运动和认知功能,本文通过检测线粒体功能和海马齿状回(DG区)细胞增殖情况探讨谷氨酸能神经元激活改善神经功能恢复的内在机制。首先,制备模型动物的神经元单细胞悬液,通过流式细胞仪检测线粒体膜电位、ELISA方法检测线粒体ATP水平和DNA氧化损伤生物标记物8-羟基脱氧尿苷(8-OHdG)的含量,揭示皮层谷氨酸能神经元对线粒体功能的影响;然后,通过5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记,免疫组织化学法,检测海马齿状回(DG)区细胞增殖情况,明确皮层谷氨酸能神经元的激活促进脑出血小鼠认知功能内在机制。实验结果表明运动皮层谷氨酸能神经元激活可以改善线粒体膜电位,提高ATP水平,缓解DNA氧化损伤,改善线粒体功能,会促进小鼠脑出血后功能恢复;针对海马齿状回新生神经元的5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记进行检测,发现海马DG区BrdU+神经元数明显升高,表明皮层谷氨酸能神经元激活后该区神经元增殖能力增强,促进脑出血后小鼠认知功能的恢复。综上所述,本文利用化学遗传学技术靶向激活运动皮层谷氨酸能神经元,通过其突触联系和纤维投射,明显促进脑出血后神经元的线粒体功能改善和海马DG区细胞增殖,有利于运动和认知功能障碍的改善。本研究揭示了运动皮层的谷氨酸能神经元激活可能是潜在的对脑出血后神经功能障碍进行靶向干预的新途径,并为药物研发及临床精准治疗脑出血导致的血肿灶周白质损伤导致的运动、感觉及认知功能障碍提供新的手段或策略。第一部分 构建hM3Dq-mCherry稳定表达的小鼠运动皮层谷氨酸能神经元激活动物模型及其生物学特征验证1.目的:构建化学遗传学技术激活运动皮层谷氨酸能神经元的动物模型,进行腺相关病毒转染并激活神经元的生物学验证。2.方法(1)本部分实验,将动物分为以下四组:Sham(假手术)组、hM3Dq组(pAAV2/9-CaMKⅡ α-hM3Dq-mCherry+ICH 模型)、mCherry 组(pAAV2/9-CaMKⅡ α-mCherry+ICH模型)和ICH组(脑出血模型对照组)。在ICH小鼠模型构建3周前,利用脑立体定向注射技术按照不同分组向小鼠右侧运动皮层M1 区两个靶点注射实验真病毒pAAV2/9-C

关键词： 神经病理性疼痛   病理分析   表观遗传学   DNA甲基化   环状RNA   调控机制  

摘要： 神经病理性疼痛的致病原因多种多样（例如:神经损伤、化疗药物使用、炎症、疾病等），一旦发生，则会严重影响患者的生存质量，给社会和家庭带来巨大的负担。但目前临床上对于这种疾病的治疗并不充分，这要归因于疾病的生理基础和分子机制并不清楚。表观遗传学调控机制在转录后的各个阶段都参与了神经病理性疼痛的进程，其研究内容主要涉及DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA调控。本研究首先围绕DNA甲基化和非编码RNA中环状RNA的调控机制在神经病理性疼痛中的作用作一总结。后续的工作研究内容中，第一部分探究了在三种不同抗肿瘤机制的化疗药物（奥沙利铂、紫杉醇、硼替佐米）应用后，均能够引起大鼠出现机械性痛觉超敏的相关机制，简述为转录因子PAX6基因去甲基化引起PAX6表达上调，进而PAX6发挥转录调控作用增加TRPC6蛋白的表达，介导神经病理性疼痛的进程。第二部分对circFhit在神经损伤诱导痛觉异常中发挥的作用进行了简单的论证，并解析了circFhit的结构特征和细胞定位。希望通过研究的不断深入，推进对神经病理性疼痛这种疾病的了解，为疾病治疗提供更加有效的治疗思路及靶点。

关键词： UV-B辐射   克隆植物   表观遗传记忆   DNA甲基化   跨世代效应  

摘要： 太阳光中的紫外-B(UV-B)辐射在植物的生长发育过程中发挥着重要的调控作用,随着人类工业化和现代化的进程,臭氧层衰减及其所伴随的地表UV-B辐射增强变得不可忽略。研究表明表观遗传变异及其所诱导的表型可塑性与植物适应新的胁迫环境密切相关。然而,相比于大量的胁迫环境中植物的表观遗传变化的报道,UV-B胁迫下植物的相关研究十分缺乏,而这对于全面揭示UV-B辐射对植物的效应,尤其是克隆植物在各生态系统中的广泛分布至关重要。在本研究中,克隆植物活血丹(Glechoma longituba)母株分别处于四种不同频率的UV-B辐射环境中(即无UV-B辐射,1天的UV-B辐射,20天UV-B辐射以及40天UV-B辐射),而子株生长于自然光条件下。41天实验结束时对母株以及各级子株的生长相关指标(生物量分配、叶面积、比叶面积SLA)以及防御性指标(紫外吸收化合物含量)的测定来确定UV-B辐射对活血丹生长及其表型的影响。并在此基础之上结合甲基化敏感多态性分析(MSAP)技术对表观遗传学指标(DNA甲基化水平)进行分析,从而探讨以下科学问题:(1)活血丹对其曾经经历过的UV-B辐射能否形成表观遗传学记忆?(2)如果能,那么不同UV-B辐射频率所形成的记忆印记程度是否不同?(3)母株的不同UV-B环境对活血丹子株生长的影响。本研究所获得的主要结果如下:(1)对其曾经经历过的UV-B辐射,克隆植物活血丹能够形成表观遗传记忆,具体表现为DNA总甲基化水平的下降。并且对不同的辐射频率所形成的记忆印记有所不同,总甲基化程度随着辐射频率的增长而逐步降低。(2)母株的UV-B辐射记忆可以跨世代进行传递,但记忆的时效性因辐射频率而异。对短期UV-B辐射(1天)所形成的记忆是短暂可逆的,而中高频率的辐射(20和40天)所诱导记忆相对较稳定。(3)母株所经历的不同UV-B辐射会导致子株以及克隆基株不同的生长行为,从而表现为不同的生存策略。例如,若母株处于低频UV-B辐射环境中,后代分株表现随机生长,即生长相关指标(生物量,叶面积及SLA)在各个分株之间随机变化;当母株处于中频辐射环境中时,后代分株表现为均匀生长;而母株遭受高频辐射时,生长投资倾向于年长的子代分株。然而,防御性物质紫外吸收物的投资分配有所不同,母株处于低频辐射环境中,更多的防御物质倾向于分配给较老的分株,而母株如果处于中、高频辐射环境中,则结果完全相反,防御物质将更多的分配给较年轻的分株。最终,在低频辐射环境中克隆基株的总生物量得到了提高,但在中高频辐射中则受到了抑制。(4)活血丹的生长指标受到母株UV-B辐射所形成的DNA甲基化变化的显著影响,而后代各级分株的紫外吸收物含量以及SLA变化与其母株的表观遗传记忆关系密切。综上所述,UV-B辐射下克隆植物的表观遗传记忆和表型可塑性的跨代效应是频率依赖性的,并且不同环境引起的表观遗传和表型的变化可能导致克隆植物的不同生长行为。本研究结果有助于我们全面深入理解UV-B辐射对植物的作用机制,以及克隆植物对环境的适应性对策。

关键词： 核心素养   科学思维   科学探究  

摘要： 高中生物课程应以发展学生的学科核心素养,培养全面发展的学生为宗旨。培养学生的核心素养既是课程教学本身的需求,也是适应高考的需求。在课堂教学中,我们可以通过巧设问题,层层推进,引导学生分析遗传现象背后的原因;深入剖析,精辟点拨,帮助学生领悟科学研究方法的精髓;自主尝试,探索总结,推动学生发现特殊的规律。最后,培养核心素养贵在坚持。

关键词： 女性   强直性脊柱炎   生育   遗传学  

摘要： 强直性脊柱炎(AS)为高度遗传倾向的血清阴性脊柱关节病,相关研究表示, HLA－B27基因和AS的强相关性.但是目前有大量研究表示除了 HLA－B27基因之外,可能还有其他M HC类与非M HS基因和AS相关.本文对女性强直性脊柱炎生育和遗传学进行研究,为其诊断、预防与治疗提供全新的思路.

关键词： 原发性家族性脑钙化   SLC20A2   最小患病率   双等位基因突变  

摘要： 研究背景:原发性家族性脑钙化（primary familial brain calcification,PFBC）又被称为Fahr病或特发性基底节钙化,是一种以双侧对称性基底节区及其他脑区钙化为影像学特点的神经退行性疾病。PFBC具有广泛的临床异质性,主要表现为精神症状、运动障碍和认知功能下降,其中36%-42%的患者无临床症状。目前共发现四个常染色体显性遗传模式的致病基因,分别为SLC20A2、PDGFRB、PDGFB和XPR1。近年来,Nicolas等人结合gnom AD数据库发现PFBC的最小患病率可达2.1‰,证明该疾病不是一个罕见病。但是由于临床选择偏倚（与有症状的PFBC患者相比,无症状的PFBC患者接受基因检测的可能性较小）,其最小患病率可能被低估。目的:探究中国PFBC患者临床表型和基因型的关系;评估PFBC在中国人群中的最小患病率。方法:本项目通过多中心回顾性研究共纳入273名PFBC先证者,根据收集方法不同将其分成两组:第一组（非系统性搜索收集）,在本研究医院诊断的37名PFBC先证者;第二组（系统性搜索收集）,用特定关键词搜索其他50家医院医学影像数据库被重新诊断为PFBC的236名先证者。收集患者的外周血提取基因组DNA和RNA,通过逆转录在c DNA水平应用聚合酶链反应（PCR）及Sanger测序技术对所有PFBC先证者筛查四个已知的PFBC常染色体显性遗传基因。检测到的所有突变通过ACMG-AMP等级进行分类并在g DNA水平验证该突变位点。参考Nicolas等人设定的PFBC最小患病率计算方法,结合本研究团队的突变检测率评估中国PFBC患者的最小患病率。结果:37名先证者在SLC20A2、PDGFRB、PDGFB和XPR1已知致病基因中检测到32个突变,包括22个新突变和10个已知突变。根据ACMG指南,其中16个突变类型可评级为致病突变（Pathogenic,5级）;8个突变类型可评级为疑似致病突变（likely pathogenic,4级）。通过以c DNA为模板扩增测序,意外发现2个SLC20A2基因外显子杂合缺失（c.（289+1＿290-1）＿（429+1＿430-1）del（p.G97＿I143del）和c.（430+1＿431-1）＿（613+1＿614-1）del（p.V144＿P204del））,以及两个剪切位点突变（c.290-8A＞G（p.G97Vfs*163）和c.289+937G＞A（p.S98Rfs*9））。此外,我们还发现两名携带SLC20A2基因纯合突变的患者（c.1168A＞G（p.T390A）和c.1765G＞A（p.G589R））,两名先证者具有严重的临床表型和颅内钙化影像学表现。在这些先证者中,无症状者比例高达83.8%（31/37）。基于第二组先证者的突变检出率,我们得出PFBC的最小患病率为6.6‰,远高于欧洲团队报道的最小患病率2.1‰。结论:我们检测出高比例的无症状患者携带PFBC的致病基因突变,这些无症状的患者因为临床选择偏倚常被忽视,从而使得PFBC的最小患病率被低估。

关键词： 骨髓增生异常综合征   高通量测序技术   分子遗传学   IPSS-R分期  

摘要： 目的:研究骨髓增生异常综合症(MDS)的基因突变谱特点以及高通量测序(High-throughput sequencing)技术在初诊MDS患者中的临床价值。背景:骨髓增生异常综合征(MDS)是一组起源于多能造血干细胞的异质性恶性髓系克隆性疾病,其特征为骨髓造血细胞异常发育、无效造血,并伴有程度不等的血细胞减少、克隆性染色体异常以及高风险向急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)转化的倾向。MDS的发生、发展是体细胞多步遗传过程的结果,在此过程中,驱动基因使体细胞产生突变并致使酪氨酸激酶通路异常激活,引起骨髓造血干细胞发育异常,过度增殖并由此形成的克隆是骨髓异常克隆造血的开端。MDS临床表现多样、预后差异较大,对于MDS的诊治难点为:***及其它类型血细胞减少及克隆性造血的早期鉴别诊断;***亚型的精确划分,疾病的动态监测;3.对于MDS治疗后的效果评估、疾病复发的早期监测。随着近年来科学技术的迅猛发展,流式细胞术及细胞遗传学等技术及学科的发展已为MDS精准分型及治疗提供了技术支撑和保障。尽管对于MDS的诊断、分型及预后判断已取得较大突破,但由于MDS具有高度异质性,目前在MDS的发生、发展中对恶性细胞的克隆演化及其生物学行为的掌握仍不尽如人意,在MDS亚型划分、个体化精准治疗、预测疾病的预后及早期复发等方面仍感不足。近年来伴随着高通量测序(High-throughput sequencing)技术的发展,不断揭示了 MDS在分子生物学层面改变的特点,为进一步深入了解MDS克隆演化、发育异常及高异质性等疾病特征提供了重要的技术支持,目前分子生物学标志物已逐渐成为疾病疗效、预后判断的特异性标识,未来分子生物学标志作为规范化治疗的参数之一将是不可阻挡的趋势。已证实一些特异性分子生物学标识与MDS的分型、预后有关联,但对于指导疾病的诊断、分型、临床靶向治疗及复发检测仍缺少大量的临床数据支持。方法:本研究回顾性分析自2016年6月至2019年7月就诊于苏州大学附属第二医院77例MDS初诊患者,并收集患者初诊时的一般临床特征(包括血常规、骨髓细胞形态学、细胞遗传学等),采用高通量测序技术检测患者基因突变,分析其分子遗传学特点与临床分期、预后积分及患者临床特点的关系。结果:77例患者中,71例患者(92.2%)存在基因突变,突变频次前五名分别为U2AF1(26.0%)、AXSL1(23.4%)、TET2(19.5%)、DNMT3A(28.2%)、TP53 与 SF3B1(16.9%);按突变基因功能分类,表观遗传学相关基因突变比例最高(34.03%)、其次为RNA剪切组(12.77%);22名(28.6%)患者存在3个及以上基因功能组的改变,这些患者疾病亚型更倾向于原始细胞增多型(MDS-EB1+MDS-EB2)(P=0.0057);突变数量≥2的患者IPSS-R分期更易偏向高危及极高危组(IPSS-R>4.5分)(P=0.0386)。结论:MDS基因突变数量及其功能数的改变与疾病的临床特征相关联,影响疾病的预后评分及亚型划分。本研究发现基因突变数量≥2的患者偏向较差的疾病亚型(原始细胞增多型);基因突变功能组改变数量≥3的患者具有较高的IPSS-R评分(>4.5分)。临床上应警惕具有该类特征患者快速进展的可能性,同时建议应将分子生物学作为评估疾病分型及预后的依据之一,从而对MDS进行个体化管理和治疗。

关键词： 遗传学  

ISBN: (纸本)9787306069528

摘要： 本书包含18个实验: 有丝分裂与染色体行为观察、减数分裂与染色体行为观察、果蝇的培养及性状观察、果蝇杂交实验、植物多倍体的诱发、人外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备、染色体组型分析、人性染色体荧光原位杂交、果蝇唾腺染色体标本制备与观察、人X染色质分析、粗糙链孢霉顺序四分子分析、微核试验、人类指纹分析、味盲基因遗传分析等, 涵盖经典遗传学、细胞遗传学和现代遗传学的基础性实验以及综合和探索性实验。

关键词： 光遗传学   GABA能神经元   阿尔茨海默症   淀粉样斑块   自噬   炎性因子   ERK1/2信号通路   神经干细胞   SDF1/CXCR4信号通路  

摘要： 背景阿尔兹海默症（Alzheimer’s disease,AD）是一种最常见的神经退行性疾病,其发病率高,起病隐匿,严重影响老年人健康。临床主要表现为学习记忆障碍、人格行为异常等。AD病因至今未明,发病机制复杂,主要病理特征有Aβ沉积、Tau蛋白磷酸化、神经元丢失等改变;目前尚无有效治疗方法。因此,AD有效治疗方法的发现及其保护机制是当今神经科学研究的热点和难点。目前,对于AD的研究主要集中在减少Aβ的产生以及Tau蛋白的过度磷酸化、减轻神经炎症和神经干细胞移植等。在AD患者脑部,Aβ的大量堆积引起神经细胞损伤,尤其是星型胶质细胞和小胶质细胞被大量激活,激活的胶质细胞一方面通过释放一些神经营养因子、吞噬清除损伤的细胞碎片和感染物质来修复神经元,另一方面释放大量炎性细胞因子加重神经元损伤。自噬参与多种疾病如肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病等的发生发展过程;现已证实炎症发生发展过程中可干扰自噬,自噬亦可负向调节炎性因子,影响甚至改变炎症的进程与转归。神经干细胞的发现和体外培养成功,为神经退行性疾病的神经功能重建和神经再生提供了新的思路,虽然通过移植外源性神经干细胞能够弥补衰老神经元的功能缺陷,但因移植排斥及伦理学等原因使得其在临床方面的应用受到限制。因此,寻求一种激活内源性神经干细胞并促进其增殖分化,达到重塑神经功能的方法,成为AD近年来研究的热点之一。哺乳动物脑内γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid,GABA）能神经元占神经元总数的10-15%左右,但GABA能神经元具有重要的生理功能,参与调控整个大脑中主要神经元的活动,如参与学习记忆的形成。有研究表明,激活GABA能神经元能够改善衰老相关的认知功能。因此,本实验拟利用光遗传学技术,特异性激活体内外GABA能神经元,观察AD模型的神经保护作用及其可能的分子生物学机制。目的利用光遗传学技术,特异性激活体内外GABA能神经元,通过神经网络功能的改变对脑内微环境及细胞亚结构的影响,观察其对AD模型的神经保护作用及脑组织中Aβ的代谢过程、炎症反应状态、自噬发生及内源性神经干细胞增殖分化等的影响,探索AD治疗的新方法,并研究其可能的分子生物学机制。第一部分 GABA能神经元激活对AD细胞模型的保护作用及自噬相关蛋白表达的影响方法1.分离、培养新生小鼠原代海马神经元,免疫荧光化学方法测定神经元特异性标志物NSE和GABA能神经元特异性标志物GAD67蛋白表达。2.利用光遗传学技术将慢病毒转染分离培养的原代GABA能神经元,慢病毒包含有GAD67启动子以及光敏感蛋白ChR2和绿色荧光蛋白EGFP。3.利用Aβ1-42损伤慢病毒转染后的小鼠原代GABA能神经元,制备AD细胞模型;光学显微镜下观察细胞形态学变化,MTT法检测Aβ1-42对细胞增殖能力的影响;4.实验分组:正常对照组,模型组（Aβ1-42损伤造模）,光刺激组（Aβ1-42+光遗传学刺激）,抑制剂组:（Aβ1-42+光遗传学刺激+抑制剂荷包牡丹碱）。5.利用光遗传学技术激活GABA能神经元,光学显微镜下观察光刺激对神经元形态学变化的影响。6.利用ELISA方法检测细胞培养液中LDH释放量的变化;观察GABA能神经元激活对细胞受损情况的影响。***-blot检测GABA能神经元激活对AD模型细胞自噬相关蛋白Beclin1及LC3Ⅱ/LC3-Ⅰ表达的影响;使用GABA-A受体竞争型抑制剂（荷包牡丹碱）对比光刺激前后自噬相关蛋白表达的变化。结果1.分离培养的原代海马神经元NSE表达阳性,约11%NSE阳性神经元同时表达GABA能神经元特异性标志物GAD67和慢病毒,二者共定位情况良好。2.不同浓度的Aβ1-42对原代海马神经元存活力的影响分别为97.9%,81.1%,69.5%和54.3%,选择抑制效果较强且对细胞损伤性较小的10μM浓度分别作用于神经元12、24、36和48h,不同时间点对细胞存活力的影响分别为99.6%,91.9%,88.1%和60.2%,呈剂量和时间依赖性;选取10μM的Aβ1-42作用48h用于后续实验研究。3.与正常对照组相比,模型组神经元出现形态学损伤性变化;与模型组相比,光刺激组可减轻损伤的发生,抑制剂组形态学损伤无明显改善。4.与正常对照组相比,模型组LDH分泌水平上调（P＜0.05）;与模型组相比,光刺激组LDH分泌水平出现下调（P＜0.05）,抑制剂组无变化。5.与正常对照组相比,模型组中自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1表达均减少（P＜0.01,P＜0.05）;与模型组相比,光刺激组LC3Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1表达水平升高（P＜0.05）,抑制剂组无变化。第二部分 CA1区GABA能神经元激活对AD小鼠神经保护作用及其机制方法***扩增实验鉴定AP