关键词：
日本血吸虫
单性感染
生殖潜能
微卫星
群体遗传学
摘要：
目的:日本血吸虫病是一种由日本血吸虫感染引起的严重危害人体健康的人畜共患寄生虫疾病,在我国仍然是一个重要公共卫生问题。随着查螺灭螺、查病治病等血防工作持久深入,血吸虫病疫情已得到有效控制,呈现为低度流行状态。既往研究多集中于雌、雄血吸虫合抱交配和合抱后雌虫发育机理,但尚无文献探讨终宿主体内的单性未合抱血吸虫(雄虫或雌虫)的生殖潜能。单性血吸虫感染终宿主是血吸虫基本生物学特性之一,在血吸虫病流行区普遍存在但至今仍被长期忽视。因此,本研究通过动物实验,探索单性寄生于终宿主(小鼠)体内的日本血吸虫的生殖潜能(先期感染的单性血吸虫,在终宿主重复感染异性血吸虫后,前、后期血吸虫能否完成雌雄合抱及雌虫恢复发育成熟产卵?)及与其遗传学特征间的关系。这将有助于阐明单性日本血吸虫感染者作为潜在传染源在血吸虫病流行病学上意义,为我国消除血吸虫病提供科学依据。方法:1.从流行区(安徽石台)采集钉螺样本,实验室进行逸蚴筛选出感染性钉螺,计算钉螺阳性率。将阳性钉螺逸出的尾蚴感染小鼠,通过回收的虫体鉴定尾蚴性别,对感染性(单性血吸虫或混合血吸虫)钉螺进行泊松分布的拟合优度检验;应用7对微卫星荧光标志引物确定血吸虫尾蚴的基因型;GenAIEx软件进行血吸虫遗传学特征分析,计算等位基因数、有效等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、近交系数等。2.用已知性别(雌性或雄性)和基因型的血吸虫尾蚴感染小鼠(即单性感染),在3个月、6个月后用相对性别尾蚴(即雄性或雌性)第二次感染小鼠(分“先雌后雄”和“先雄后雌”),第二次感染1个月后解剖小鼠,收集血吸虫虫体(包括合抱数、单雌、单雄),计算平均每克肝脏孵化毛蚴数及每对成虫产卵孵化毛蚴数。通过Kruskal-Wallis(K-W)检验比较“先雌后雄”3个月和6个月这2组回收虫体的合抱数、平均每克肝脏孵化毛蚴数及每对成虫产卵孵化毛蚴数是否存在差异;同理,进行“先雄后雌”3个月和6个月比较。3.提取雌、雄成虫DNA,应用微卫星标记进行基因分型,判断实际基因型组合情况;同时取每只小鼠肝脏虫卵,孵化毛蚴,随机抽取20条毛蚴进行基因分型,通过家系分析,了解各对成虫产卵情况。SPAGeDI 1.4软件计算r系数计算配对虫体间的遗传相似性;采用Pearson相关分析配对虫体间的遗传相似性与其数量及子代毛蚴数量的关系,利用SAS 9.4统计软件进行统计学处理。结果:1.对流行区(石台)感染性钉螺的分布的调查,发现:1)现场采集13412只钉螺,筛选得到阳性钉螺94只,钉螺感染率0.7%;从阳性钉螺中随机抽取60只进行尾蚴的性别鉴定,最终成功鉴别57只,结果发现27只钉螺逸出雌性尾蚴,30只钉螺逸出雄性尾蚴,血吸虫性别之比接近1比1,无混合血吸虫感染的钉螺。另外从小鼠体内收集的虫体数发现,雄虫数量的均数和中位数高于雌虫数,经K-W秩和检验,两组之间的差异有统计学意义,即雄性血吸虫尾蚴感染小鼠得到的虫体数要高于雌性。2)感染性钉螺中血吸虫性别分布经拟合优度检验表明感染性钉螺的分布服从Poisson 分布(P>0.10)。3)不同性别尾蚴的遗传多样性分析结果表明:雄性与雌性尾蚴的平均等位基因数分别为6.143、5.857,有效等位基因数分别为3.052、3.082,可见雄性和雌性尾蚴的遗传多样性水平相近。2.单性感染日本血吸虫在终宿主体内的生殖潜能1)“先雌后雄”组:从先雌性血吸虫尾蚴感染3个月后再雄性血吸虫感染、先雌性血吸虫尾蚴感染6个月后再雄性血吸虫感染,小鼠体内回收的合抱虫体数的平均水平分别为9.0(7.0-15.0)、24.5(12.0-28.0);平均每克肝脏孵化毛蚴数分别为62.0(51.0-74.0)、607.5(168.0-1611.0);平均每对成虫产卵孵化毛蚴数分别为13.2(10.2-19.8)、82.8(27.4-135.8),经 K-W 检验,P<0.05,两组差别有统计学意义。2)“先雄后雌”组:先雄性血吸虫尾蚴感染3个月后再雌性尾蚴感染、先雄性血吸虫尾蚴感染6个月后再雌性尾蚴感染,小鼠体内回收的合抱数的平均水平分别为18.0(10.0-43.0)、10.0(5.0-11.0),经K-W检验,P>0.05,两组差别无统计学意义;平均每克肝脏孵化毛蚴数分别为802.0(745.0-1765.0)、111.0(27.0-150.0),平均每对成虫产卵孵化毛蚴数分别为 139.6(110.0-225.3)、35.3(13.0-42.7),经 K-W 检验,P<0.05,两组差别有统计学意义。3.单性血吸虫生殖潜能与其遗传学特征间的关系1)雌雄成虫间的遗传相似性与其数量的关系:先雌后雄3个月组,配对雌雄成虫间的遗传相似性与其数量(r=0.08373,P>0.1)呈正相关;先雌后雄6个月组,配对雌雄成虫间的遗传相似性与其数量(
