关键词：
光遗传学
心脏交感神经
心肌梗死
室性心律失常
摘要：
背景:室性心律失常(ventricular arrhythmia,VA)是绝大多数心脏病患者发生心源性猝死(sudden cardiac death,SCD)的主要原因。自主神经系统在维持心血管系统正常功能中发挥重要作用,而心脏自主神经失平衡在多种心血管疾病如高血压、冠心病、心衰和心律失常的发生和发展进程中发挥重要作用。研究表明,心脏交感神经系统过度激活,尤其是左侧星状神经节(left stellate ganglion,LSG)过度激活在VA和SCD的发生中发挥重要作用,动物实验和临床研究均证实心脏交感神经去除术能够有效的预防VA和SCD事件。然而,由于心脏交感神经去除术易出现出血、胸痛、霍纳综合征等并发症,并且切除LSG的同时也失去了其正常的生理结构和功能,并未得到广泛应用。光遗传学(optogenetics)是一项结合了光学和遗传学技术可精准调控神经元活性的新兴生物工程技术,其原理为采用基因工程技术在靶细胞内表达兴奋性或抑制型光敏感蛋白,并通过特定波长的可见光调控激活光敏感蛋白导致靶细胞内外离子变化,从而实现对靶细胞毫秒级的快速精准调控。Arch T是一种抑制型光敏感蛋白,当其在靶细胞中表达并通过适当波长的照射激活时,可诱导细胞超极化,从而抑制细胞活性。目的:1.探讨光遗传学技术对心脏交感神经活性的调控作用;2.探讨光遗传学调控心脏交感神经活性对心脏电生理性质及急性心肌梗死后VA的影响;3.自主研发无线可植入光遗传学设备,探讨在清醒动物中长期进行光遗传学心脏神经调控的可行性和安全性,并探讨慢性无线光遗传学心脏交感神经调控对慢性心肌梗死后心脏自主神经、电生理、功能和结构重塑及VA的影响。方法:所有实验犬均以戊巴比妥钠30mg/kg静脉诱导麻醉,实验过程中以60mg/h戊巴比妥钠维持麻醉;气管插管连接正压呼吸机辅助呼吸;标准肢体导联持续记录体表心电图;左侧股动、静脉分离置管,动脉通道持续监测动脉压,静脉通道以100ml/h滴注生理盐水补充术中体液流失。心电图、血压监测信号接入Lead7000多导电生理仪系统。使用加热垫维持实验犬的体温为36.5±0.5℃。1.20只实验犬随机分为光遗传学组和对照组,麻醉状态下经左侧第三肋间隙开胸,基础状态下记录心电图进行心率变异性(HRV)分析,高频电刺激方法测定LSG功能,直接神经活性记录方法测定神经活性。光遗传学组LSG注射病毒AAV2/9-CAG-Arch T-GFP,对照组LSG注射结构相似但无Arch T的空载病毒AAV2/9-CAG-GFP。病毒转染表达4周后,在LSG表面置入发光波长为565nm的LED光电极,分别在无LED光照,瞬时LED光照,30min持续LED光照后即刻、1h和2h进行HRV分析,测定LSG功能和神经活性。实验结束后,获取LSG组织进行组织学分析,验证GFP/Arch T-GFP表达情况。2.20只实验犬随机分为光遗传学组和对照组,麻醉状态下经左侧第三肋间隙开胸,光遗传学组LSG注射病毒AAV2/9-CAG-Arch T-GFP,对照组LSG注射结构相似但无Arch T的空载病毒AAV2/9-CAG-GFP。病毒转染表达4周后,直接神经活性记录方法测定LSG神经活性,记录心电图分析HRV;在LSG表面置入LED光电极,分别在无LED光照、瞬时LED光照,30min持续LED光照后即刻、1h和2h测定心室有效不应期(ERP)和动作电位时程(APD),分析APD回复曲线最大斜率(Smax);分离结扎冠状动脉左前降支制作急性心肌梗死模型,心梗30min再次测定LSG神经活性和HRV,记录心梗后1h心电图分析VA事件;实验结束后,获取LSG组织进行组织学染色检测神经元中c-fos和神经生长因子(nerve growth factor,NGF)的表达水平。3.18只实验犬随机分为对照组、心梗组和光遗传学组,麻醉状态下经左侧第三肋间隙开胸,暴露LSG,光遗传学组和心梗组LSG注射病毒AAV2/9-hsyn-Arch T-GFP-WPRE-p A,对照组LSG注射结构相似但无Arch T的空载病毒AAV2/9-hsyn-GFP-WPRE-p A。病毒转染表达4周后,光遗传学组置入无线LED模块,其中LED光电极植入于LSG表面,电源接收器植入于胸壁皮下,整个LED植入子由外部无线充电模块供电;分离结扎冠状动脉左前降支制作慢性心肌梗死模型,在LAD结扎后即刻给予LSG光照调控1小时,之后每天给予LED光照1小时,持续4周。心梗4周后,超声评估心脏功能和室壁运动;血清采样测定去甲肾上腺素水平;记录心电图分析HRV;测定LSG功能和神经活性;程序刺激法测定心室ERP和APD,评估VA可诱发性和室颤阈值;实验结束后,获取LSG组织与心脏组织,进行组织学染色,检测心梗面积、心室重
