关键词：
肠道菌群
遗传学
统计基因学
直肠癌
同步放化疗
摘要：
目的:研究直肠癌患者在同步放化疗过程中以及治疗前、后,肠道菌群的构成所出现的动态变化情况;以及这种菌群变化与放化疗后的不良反应严重程度的相关性。对象与方法检测直肠癌患者同步放化疗后的肠道菌群的构成,选取2018年6月至2019年6月之间就诊于吉林大学第一医院放疗科住院部的直肠癌患者19例,在其进行同步放化疗的过程中收集粪便样本,同时进行放化疗不良反应评分,并收集临床资料。本研究获得患者本人或家属同意后签署知情同意书。1.提取粪便基因组;扩增其16S rDNA的V3-V4区,应用Illumina Miseq平台测序分析其肠道菌群基因组构成。2.使用DESeq软件分析各治疗时间段中,相对丰度具有显著差异的菌群;并计算各时期的α和β多样性指数。3.使用“不良事件评估表”评估放化疗后不良反应的严重程度,评估角度包括腹泻评分。4.使用随机森林-回归方法明确放化疗后不良反应的严重程度与肠道菌群是否存在相关性,以及哪些菌群相关性更加明显。5.构建“复合型回归模型(two-part regression model)”,分别明确肠道菌群与放化疗后不良反应的相关性是来自于其相对丰度的变化,或是来自于该菌群存在与否,或是两种因素皆有影响。6.为明确在众多因素(包括年龄、性别和BMI指数等)中,肠道菌群对于患者放化疗不良反应严重程度的变异情况的解释程度,建立训练集和测试集的交叉验证。于测试集中按照FDR<0.05水平选择有统计意义的菌群,并使用“复合型回归模型”求得每个菌群的效应值;然后,于测试集中建立不良反应评分与肠道菌群总水平的回归模型,相关系数(R)代表肠道菌群对于患者放化疗不良反应严重程度的变异情况的解释程度。结果肠道菌群分析,共得到最终110例样本,平均每样本序列条数为13428条,有效评价读长为250.0 bp,使用Qiime2 dada2及Qiime2 Vsearch软件,参照公共菌群数据库Greengene,将相似度大于97%的序列进行聚类后共获得1042个操作分类单元(OTU),这些OTU进行比对后,最终对应418个菌群。稀释曲线提示,随着测序条数的不断增加,测序深度达2000 bp后各个样本的稀释曲线均趋于平缓。1.放化疗20次较放化疗第10次,肠道菌群的OTU数量和香农指数明显下降(observed species RT2=106,observed species RT4=82,FDR-corrected P=0.00502;Shannon index RT2=6.09,Shannon index RT4=5.69,FDR-corrected P=0.00284)。主成分分析法显示,放化疗20次较放化疗5次时的菌群构成有明显的差异(weighed Uni Frac distance metric:R2=0.36,FDR-corrected P=0.040 5);放化疗结束后较放化疗15次时的菌群构成有明显的差异(unweighted Uni Frac distance metric:R2=0.37,FDR-corrected P=0.040 2)。***分析指出,在菌属水平,以下菌属在放化疗后较放化疗前出现的相对丰度明显下降,包括Papillibacter和Anaerotruncus(>4倍,FDR-corrected P<0.05),Lactobacillus、Odoribacter和Peptostreptococcus(>8倍,FDR-corrected P<0.05);以下菌属在放化疗后较放化疗前出现的相对丰度明显上升,包括Coprococcus、Rothia、Parabacteroides、Bacillus、Weissella和Prevotella(>4倍,FDR-corrected P<0.05),Alkanindiges、Actinomyces和Selenomonas(>8倍,FDR-corrected P<0.05)。在菌门水平,以下菌门在放化疗后较放化疗前出现的相对丰度明显上升,包括Cyanobacteria和TM7(>8倍,FDR-corrected P<0.05);以下菌门在放化疗后较放化疗前出现的相对丰度明显下降,Synergistetes(>4倍,FDR-corrected P<0.05)。3.随机森林-回归方法共获得28个与放化疗不良反应相关的“标志性菌群”,在该模型中,肠道菌群可解释5.63%不良反应变异(P<0.05),其中相关性高的菌群包括Peptostreptococcus、Anaerosinus和Parabacteroides等。4.在“复合型回归模型”中,分析得出共32个菌群与放化疗后不良反应具有线性回归关系,其中7个来自定量分析模型,9个来自定性分析模型,16个来自定性-定量结合
