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关键词： 假性软骨发育不全   干细胞   胚胎植入前遗传学检测   内质网应激   分子动力学模拟  

摘要： 目的:假性软骨发育不全(PSACH)是一种罕见的常染色体显性遗传病,患病率约为1/30000,与软骨寡聚基质蛋白(COMP)基因突变相关,其特征是短肢型侏儒、鸭步态和早发性骨关节炎等。患者通常在出生时身高和体重无异常,在18-24个月左右出现生长迟缓,成年个体身高通常在82-130厘米之间。临床中,针对PSACH尚无有效的干预手段。COMP基因位于19号染色体,编码COMP蛋白。COMP蛋白是一种细胞外基质糖蛋白,是血小板反应蛋白家族成员之一。COMP蛋白,由5个亚单位组成,每个亚单位有一个N端结构域、四个表皮生长因子区、七个T3重复区和一个羟基末端球状区(CTD)。T3重复区和CTD区富含钙离子结合位点,在蛋白质折叠中起主导作用。在已经发现的200多个导致PSACH的突变中,85%位于T3重复区,15%位于CTD区。电镜研究发现,T3区域突变引起的PSACH患者软骨细胞粗面内质网(ER)中积聚了大量突变的COMP蛋白和其他细胞外基质蛋白,进而引起内质网应激,导致软骨细胞过早凋亡,引发软骨内骨形成受损。目前,CTD区域突变引起的PSACH的发病机制尚无明确定论,有待进一步探索。本研究拟基于高通量测序(NGS)和单核苷酸多态性(SNP)连锁分析技术设计、优化并实施一项针对PSACH的胚胎植入前遗传学检测方案(PGT),避免高遗传风险患儿的出生;同时建立PSACH特异性诱导多能干细胞系(iPS)和经血源间充质干细胞系(MenSCs),克服人源标本来源不足和模式动物的物种限制;利用干细胞模型通过体外和计算机模拟的方法来探究致病性c.1675G>A(p.E559K)变异对COMP蛋白结构和功能的影响,探讨PSACH疾病相关致病分子机制,为疾病的治疗奠定基础。方法:收集于中国医科大学附属盛京医院生殖医学中心就诊的PSACH患者家系临床信息和样本,明确家系携带的基因变异位点,利用文献数据库检索和生物信息学预测软件对变异位点进行致病性评价,并依据美国医学遗传学和基因组学学会(ACMG)发布的针对序列变异的解读标准和指南进行变异位点的有害性分类,明确变异致病性。患者于月经第3天,采用拮抗剂方案促排卵,取卵后行卵胞浆内单精子显微注射,受精卵培养至囊胚期,进行滋养层细胞活检。应用NGS联合SNP连锁分析技术进行PGT检测,筛选出正常囊胚进行冷冻囊胚解冻移植。取患者和正常人月经第2-3天废弃月经血,分离培养MenSCs,传代扩增并鉴定。采用慢病毒法诱导MenSCs重编程,获得PSACH疾病特异性iPS细胞系。通过免疫荧光检测多能性标记物OCT4、SOX2、Nanog,实时荧光定量PCR检测内源多能性基因和外源重编程基因相对表达量,体外分化拟胚体实验鉴定i PS细胞多能性,并对细胞系COMP基因测序验证变异位点。利用体外定向分化技术诱导正常对照组和PSACH组MenSCs成软骨分化,分别于第0天、7天、14天收集软骨细胞提取RNA反转录扩增,实时荧光定量PCR检测COMP、SOX9、COL2A1、COL1A2、COL1A1、ACAN等软骨标记物的转录水平。取两组成软骨分化第21天的软骨小球进行甲苯胺蓝染色,计算并比较染色阳性率,采用TUNEL法检测软骨细胞的凋亡水平。同时采用电镜观察体外诱导的软骨细胞超纤维结构,利用实时荧光定量PCR检测内质网应激特异性标记的表达情况。从蛋白质结构数据库获取野生型COMP蛋白的结构模型,利用点突变建立c.1675G>A(p.E559K)蛋白的三维模型,并评估结构模型的合理性。采用GROMACS进行分子动力学模拟,获取轨迹文件,计算分析均方根偏差(RMSD)、均方根涨落(RMSFs)、回旋半径(Rg)、溶剂可及表面积(SASA)和二级结构,并采用Xmgrace和R软件绘图。本研究所有研究内容均经中国医科大学伦理委员会批准,患者按要求签署知情同意书后执行。结果:通过对该家系进行遗传学分析后,发现该家系患病者均携带COMP基因c.1675G>A(p.E559K)杂合变异,家系内正常个体不携带该变异。依据ACMG遗传变异分类联合标准规则评估c.1675G>A变异为可能致病性的基因变异。结合患者临床表现,经权威遗传学专家评估后,明确c.1675G>A(p.E559K)变异为该家系致病变异位点。患者促排后获卵9枚,受精9枚,囊胚培养4枚,PGT结果提示,1枚胚胎符合移植标准,行冷冻囊胚解冻移植,成功妊娠,于妊娠中期进行羊水穿刺检查,测序结果提示胎儿未携带该变异位点。患者已于2019年6月顺利分娩一健康男婴,目前生长发育良好。从患者及正常人月经血分离培养获得的MenSCs表达CD44、CD73和CD105,不表达CD34、CD38和CD45,且可诱导分化成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞,符合间充质干细胞特性。采用慢病毒感染诱导MenS

关键词： SOX9基因   弯肢发育不全   骨骼发育不良   先天性椎体畸形   全外显子测序  

摘要： 研究背景:骨骼发育不良(Skeletal Dysplasia,SD)是一类影响骨与软骨发育的遗传性骨骼畸形。弯肢发育不全(Campomelic dysplasia,CD)是一种由SOX9基因突变引起的常染色体显性遗传的SD,其临床特征是先天性的尤其发生在下肢长骨短缩、弯曲、肩胛骨发育不良、髂翼狭窄、胸椎椎弓根矿化不足等。由于胸腔狭小和气管、支气管发育不全有关的呼吸功能不全使得患者通常在出生后的一年内死亡。SOX9基因突变导致的CD通常会伴随46,XY性别反转。有10%CD患者不存在长骨弯曲,称为AcampomelicCD(ACD)。尽管目前研究已经证实CD以及ACD均是由S0X9基因突变引起,但是具体的作用机制尚未研究清楚。先天性椎体畸形(congenital vertebral malformations,CVM)是属于骨科范畴的SD,以先天性脊柱侧凸(congenital scoliosis,CS)为主,是一种严重的先天脊柱发育异常,是造成青少年残疾的主要疾病之一。CVM可单纯表现为脊柱椎体畸形,同时脊柱畸形也可能只是许多综合征性CVM的临床表现之一。CD/ACD常合并脊柱畸形,具有较强的致残、致畸率。由于临床医生缺乏对综合征性CVM的充分认识,可能会导致在诊疗过程中对此类患者的漏诊或误诊。因此,在CVM患者中开展SOX9基因的相关研究对提高综合征性脊柱畸形诊断率以及探究SOX9基因相关骨骼畸形的致病机制具有重要意义。研究目的:1.对CVM患者进行全外显子测序(Wholeexomesequencing,WES),筛选SOX9候选致病位点。2.体外实验验证候选突变位点的功能改变,探寻SOX9致病的潜在病理机制。3.构建基因编辑小鼠模型,深入研究SOX9基因突变导致CVM的致病机理,为CVM的临床诊断和精准靶向治疗提供新的方向和思路。研究方法:我们对 DISCO 研究组(Deciphering Disorders Involving Scoliosis and COmorbidities)收集的570例CVM患者以及2000例无脊柱畸形人群的血样进行WES测序,测序得到的原始数据使用课题组自主研发的分析流程(PUMchPipeline,PUMP)进行分析。结合生物信息学分析以及病人临床表型筛选出高度可疑致病的SOX9突变位点,然后对相应的突变位点进行体外功能实验以明确其致病性。最后,采用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了Sox9基因突变小鼠模型,并采用组织病理学方法初步研究了Sox9基因突变小鼠脊柱及椎间盘的病理改变。研究结果:1.我们在570名CVM患者中,共发现7名患者携带5个相对致病性较高的SOX9错义突变(Missense)位点。它们分别为:Ile73Thr、Met113Leu、Ala133G1、Gly276Cys以及Met469Val。通过详细、系统的随访,我们发现携带Ile73Thr、Met113Leu及Ala133Gly突变的患者除了脊柱畸形外,还存在腭裂、小颌畸形等其他系统畸形。结合突变位点的生物信息学分析,我们怀疑此3位患者有可能为ACD患者,另外携带Gly276Cys以及Met469Val突变的患者均只表现为CS,以上两个突变很有可能是CS新致病突变位点。2.我们通过 Western Blot、Immunofluorescence、Luciferase 以及 EMSA 体外功能实验证实以上5个突变均为有害性突变。结合病人的临床资料、WES测序数据分析以及体外功能验证,我们认为携带Ile73Thr、Met113Leu以及Ala133Gly突变的三名患者符合ACD的分子诊断。另外,Gly276Cys以及Met469Val突变均尚未被国内、外文献报道,但是表现出了 SOX9反式激活作用下降,因此我们认为这两个突变为导致CS的新致病位点。3.我们通过CRISPR/Cas9技术成功构建了Sox9基因D272Del突变小鼠模型。我们发现纯合突变Sox9del/del小鼠与我们队列里发现的Gly276Cys突变病人的表型一致,尾椎发生了脊柱侧凸畸形。椎体的ABH/OG染色发现小鼠尾椎椎体骨骼发育存在异常,椎间盘形态也发生改变。4.D272Del突变位置与我们病例组Gly276Cys突变病人的突变位点均位于Sox9的K2功能域,Luciferase实验也进一步验证D272del跟Gly276Cys一致,同样影响了 Sox9的反式激活作用,因此我们认为K2功能异常可能跟CS的形成密切相关。研究结论:本研究共发现7名患者携带5个致病性较高的SOX9错义突变位点。通过体外功能实验证实以上5个突变均为有害性突变,结合病人的临床表型,我们对3例之前临床诊断为CVM的患者给出了 ACD的分子诊断,同时证实了Gly276Cys

关键词： Epigenetics   Decolonization   Indigenous   Genetics   Thrift Gene   Two-Eyed Seeing  

摘要： Epigenetics is the study of gene expression that does not entail alterations to the actual DNA. Decolonization is a theoretical and political movement that seeks to deconstruct colonial institutions and ideologies and reconstruct new and balanced approaches that accept and respect Indigenous worldviews. This project studies the decolonizing potential of epigenetics. Using genealogy as the method, the study establishes a long history of reductionist and deterministic thought that shaped the study of genetic science. Particular instances like thrift gene theory are explored to highlight how genetic explanations have been detrimental to the health and wellbeing of Indigenous people and illustrate the need for decolonization. The conclusion encourages the use of epigenetics as a decolonizing science that can be applied to Indigenous community-based research projects.

关键词： 医学遗传学  

ISBN: (纸本)9787117298834

摘要： 本书共17章, 包括遗传的分子基础、遗传的细胞学基础、染色体畸变与染色体病、单基因遗传病、多基因遗传病、线粒体遗传病、群体遗传学、生化遗传学、药物反应的遗传基础、免疫遗传学、肿瘤遗传学、出生缺陷、表观遗传学、遗传病的诊断、遗传病的治疗、遗传病的预防等。

关键词： 呼吸道感染   中西医结合   综述  

摘要： 反复呼吸道感染在婴幼儿时期常见,一般是在一年之内发生呼吸道感染的次数超过正常范围的疾病,得这种疾病的患儿亦称"复感儿",其患儿约占儿科门诊病例的30%,常见于学龄前儿童,是儿童时期的常见病、多发病。引起婴幼儿喘息的原因众多,具体发病机制不明。本文从中西医结合的角度,对近年来相关文献的整理,对复感儿的研究现状进行综述。1 小儿复感表观遗传研究现状小儿复感的发生与机体的表观血象及血清中一些免疫因子关系密切,研究发现,外周血中相关的I

关键词： 等边浅蛤   线粒体基因组   系统进化   遗传多样性   谱系地理学   海洋景观遗传学  

摘要： 等边浅蛤（Macridiscus multifarius）,隶属于软体动物门（Mollusca）、双壳纲（Bivalvia）、帘蛤目（Veneroida）、帘蛤科（Veneridae）、浅蛤属（Macridiscus）。具有较高的食用及经济价值,是我国沿海重要经济贝类。但近年来随着全球气候变化、海洋污染加剧、过度捕捞等原因导致其资源量下降。本研究利用线粒体全基因组序列分析等边浅蛤在帘蛤科中的进化地位,期望为帘蛤科研究积累分子数据。同时采用线粒体16S rRNA基因、Cytb基因以及COX3基因对我国沿海7个等边浅蛤群体的遗传多样性及遗传结构进行分析,并结合环境因子分析其种群海洋景观遗传特性。进一步为等边浅蛤资源保护与开发利用,贝类养殖过程中优质亲贝的选择以及对短浮游期贝类遗传结构研究提供一些基础科学数据。研究结果如下:1.本研究通过二代高通量测序获得了等边浅蛤的线粒体基全因组序列,呈现环状闭合的双链DNA结构。包含13个在重链编码的蛋白质编码基因、22个tRNA基因及2个rRNA基因。线粒体基因组及蛋白质编码基因均具有AT偏好性。包括等边浅蛤在内的16个帘蛤科物种的CDS区及一个缢蛏作为外群构建的系统进化树结果显示:等边浅蛤亲缘关系最近的为菲律宾蛤仔,其次是巴菲蛤属,再次是镜蛤属,而文蛤属物种与青蛤及紫石房蛤亲缘关系更近。2.本研究以16S rRNA、Cytb、COX3基因作为分子标记分析了等边浅蛤遗传多样性与遗传结构。结果显示,以16S rRNA基因作为分子标记共获得194条长度为722bp的16S rRNA序列,检测到28个单倍型,24个变异位点,单倍型多样性（Hd）为0.7698,核苷酸多样性（Pi）为0.00206。以Cytb基因作为分子标记共获得199条长度为746bp的Cytb序列,检测到32个单倍型,18个变异位点,单倍型多样性（Hd）为0.90132,核苷酸多样性（Pi）为0.00520。以COX3基因作为分子标记共获得203条长度为461bp的COX3序列,检测到22个单倍型,10个变异位点,单倍型多样性（Hd）为0.73775,核苷酸多样性（Pi）为0.00444。总体展现了中等偏高水平的单倍型多样性,及较低水平的核苷酸多样性。遗传分化系数(FST)、STRUCTURE、单倍型网络图（Network）均显示等边浅蛤七个群体主要分为2个谱系,其中南海群体北海（BH）与防城港（FCG）为一个谱系,东海群体漳浦（ZP）、长乐（CL）、马站（MZ）、南麂（NJ）、舟山（ZS）为一个谱系,谱系的形成主要受更新世冰期影响。三个分子标记的AMOVA分析结果一致显示变异更多在种群内发生,中性检测结果符合中性进化。三个分子标记结果不完全相同,经过对比发现Cytb基因作为分子标记更为灵敏,结果也更为可信。3.基于三个分子标记分别对五种环境因子:平均气温（SKT）、总降水（TOP）、平均海平面气压（SLP）、地表净太阳辐射（SSR）、盐度（S）、日照时数（SUND）与等边浅蛤的单倍型分布进行CCA分析、与群体分布进行PCA分析。结果显示,温度与降水为影响单倍型及群体分布的主要因素。幼虫分布模拟结果与谱系地理学结果一致,等边浅蛤的遗传结构的形成主要受群体所处的地理环境、洋流及浮游幼虫期特性影响,地理环境及洋流通过影响等边浅蛤在浮游幼虫期的扩散从而影响其遗传结构的形成。综合以上实验结果,等边浅蛤在帘蛤科内与菲律宾蛤仔亲缘关系最近,线粒体基因组具有AT偏好性。等边浅蛤在种内呈现了中等偏上的遗传多样性水平。主要分化为两个谱系,南海群体FCG、BH为一个谱系,东海群体ZS、NJ、CL、MZ、ZP为一个谱系,谱系结构的形成与更新世冰期、东海南海的近岸洋流、地理环境及浮游幼虫期短有关。六种环境因子中,温度及降水对单倍型及群体分布影响最大,在高温高降水地区更易产生某种单倍型。本研究对等边浅蛤的种质资源保护及贝类养殖提供了重要的参考价值。

关键词： 脊髓小脑共济失调11型   SCA11   TTBK2基因   高通量测序  

摘要： 背景:脊髓小脑共济失调11型（Spinal cerebellar ataxia 11,SCA11）是一种罕见疾病,其特征是进行性小脑共济失调、异常眼部体征。SCA11诊断主要是通过基因检测TTBK2的致病变异来确定。目前世界上已报道5个SCA11家系,本研究中,我们首次报道中国遗传性脊髓小脑共济失调11型家系。方法:详细收集该家系患者的临床表现、颅脑影像学、电生理学资料,并采用全外显子组测序和一代测序验证的方法确定包括5名受累个体在内的三代家系系谱中的致病基因突变。回顾分析该家系患者的临床表现、颅脑影像、电生理学和遗传学特点。结果:先证者和患病成员均约40岁时无明显诱因出现小脑性共济失调、构音障碍、眼球震颤和斜视。颅脑MRI显示小脑萎缩和延髓轻度萎缩。肌电图显示广泛神经源性损害。下肢体感诱发电位显示脊髓-脑干-皮质传导通路损害。遗传分析显示,编码tau-微管蛋白激酶2的TTBK2基因发现一个新的错义点突变（c.3290T＞C）,该突变导致氨基酸改变（***1097Ala）。在本家系中,该突变与表型共分离。经生物信息学分析,该突变在种群中的突变率非常低,变异氨基酸在物种间高度保守,对突变位点的蛋白质功能预测是有害的,突变位点致病性预测表明可致病。结论:中国首个SCA11家系患者具有小脑共济失调步态、构音障碍表现,影像学可发现小脑明显萎缩、延髓轻微萎缩。部分患者电生理检查发现伴随周围神经损害。该家系致病突变为TTBK2基因的c.3290T＞C突变。

关键词： 分子遗传学  

ISBN: (纸本)9787122356963

摘要： 本书是作者根据科研与教学实践，在深入研读并分析大量有关文献资料的基础上，经过近八年的艰苦努力撰写而成的一部崭新的分子遗传学著作。全书共十二章，分上下两册出版。上册主要包括遗传的物质基础、基因的分子结构和遗传信息的传递途径等章节;下册重点涉及基因表达的调节、突变重组与转位以及表观遗传学和模式生物等内容。在重点讨论分子遗传学基本原理的同时，作者还着力反映当今相关研究领域的许多新内容和最新进展。

关键词： 假性甲状旁腺功能减退症   PTH抵抗   GNAS外显子甲基化异常   低钾血症   Albright遗传性骨营养不良症  

摘要： 背景假性甲状旁腺功能减退症（PHP）是以甲状旁腺素（PTH）抵抗为特征的一组高度异质性的代谢性疾病,主要病因是GNAS基因或其上游分子出现异常。根据靶器官对外源性PTH的反应异常在环磷酸腺苷（c AMP）产生之前或者之后,可以将PHP分为I型和II型。PHP-I型包括PHP-Ia、PHP-Ib和PHP-Ic三个亚型:PHP-Ia是由于GNAS基因的失活性突变所导致的,该型患者除PTH抵抗外还经常存在多种激素抵抗（促甲状腺激素、促性腺激素、促生长激素释放激素等）,通常出现典型Albright遗传性骨营养不良症（AHO）,体外检测刺激性G蛋白α亚单位（Gsα）活性减退;PHP-Ib是由GNAS基因上游另外4个外显子的甲基化异常所致,患者仅有PTH抵抗或轻度TSH抵抗,一般不出现AHO;PHP-Ic患者与PHP-Ia患者有相似的临床表现和生化结果的异常,包括AHO表型和多种激素的抵抗,但与PHP-Ia相比,体外检测Gsα活性正常。该类疾病的发病率较低,临床上容易出现漏诊和误诊,因此通过GNAS基因的相关检测结合患者的临床表现、实验室检查和分子生物学检查可以更好的帮助诊断和治疗。为了提高对PHP疾病的认识,本研究主要探讨了一例PHP患者及其家系的临床表现和分子遗传学分析。方法对1例确诊的PHP患者及其家系成员进行回顾性分析,分析他们的临床表现、实验室结果并结合基因和分子生物学检测,结合相关文献来探讨PHP疾病的临床表现、诊断分型等。对患者及其家系成员共4人进行外周血基因组DNA样本提取,行GNAS基因全外显子突变检测;采用甲基化特异性聚合酶链式反应（MSP）检测GNAS基因的三个差异性甲基化区域（DMR）的甲基化状态,通过基因测序确认。综合检测结果,从分子遗传学角度对该类疾病进行诊断分类和机制的探讨。结果1.本文结合临床表现和实验室检查结果确诊了1例假性甲状旁腺功能减退症的患者。该患者存在低钙血症、高磷血症、低钾血症、血清PTH升高,没有明显AHO表型,临床诊断为PHP-Ib型。该患者GNAS基因1-13号外显子突变检测未见致病突变,通过甲基化/非甲基化引物扩增三个DMR区域,提示A/B（也称1A）区域甲基化缺失,NESP55区域过甲基化。2.该患者的父母和妹妹体形均无明显异常,均无AHO表型,血钙、血磷和血清PTH水平正常。患者父母和妹妹的3个DMR区域甲基化检测未见明显异常。结合患者分子生物学检查结果、无阳性家族史且家系成员的相关检查未发现明显异常,诊断该例患者为散发性病例,即散发型PHP-Ib患者。3.该患者入院时血钾低,同步24h尿钾排泄增高,肾性失钾明确,血气提示PH值正常,血浆肾素浓度增高,PHP-Ib合并Bartter综合征不能除外,但Bartter综合征相关基因检测结果阴性,不支持合并Bartter综合征。结论本研究通过对1例“低钙合并低钾”患者的临床资料的全面分析,进一步运用分子生物学手段进行GNAS基因突变和表观遗传学修饰检测,结合家系成员的临床和基因特征确认患者符合散发型PHP-Ib特点;分子生物学手段对于PHP患者进一步的诊断和分型起到重要的作用。