关键词：
肝细胞肝癌
癌胚分子
lncRNA MIR4435-2HG
circPVT1
摘要：
全球范围内,原发性肝癌是发生率第六、致死率第四的恶性肿瘤,且其发生率还在持续上升。乙型肝炎、丙型肝炎感染,肝硬化,过量饮酒和摄入黄曲霉毒素是导致原发性肝癌的公认危险因素。中国是肝癌高发地区,根据流行病学研究统计,仅2015年,全国新发肝癌病例就达到了46万例。目前,肝癌切除术仍是肝癌治疗的首选方法。但由于早期肝癌症状不明确、生长特性隐匿,多数患者被确诊时已处于疾病的中、晚期,可选择的治疗手段有限且效果甚微。研究显示,肝癌的发生发展是一个多步骤、多因素的复杂过程,受遗传学和表观遗传学改变的累积驱动。但是,人们对肝癌发生的具体分子机制仍知之甚少。因此,探索肝癌的发生机制,明确肝癌发生过程中的关键分子事件,对于肝癌的早期诊断和有效治疗至关重要。病理学和分子生物学研究显示,胚胎发育和肿瘤发生具相似性,共享许多关键信号通路和调控因子。癌胚分子就是指这一类在胚胎发育早期和肿瘤发生过程中高表达,而在成年阶段低表达,甚至不表达的分子。这种在肿瘤中重新激活的特殊表达模式,表明癌胚分子可能在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。在肝癌研究中,甲胎蛋白（AFP）是最早被报道的癌胚分子,目前已经作为血清检测标志物广泛应用于临床诊断。此后,GPC3（glypican-3）、SALL4（spalt like transcription factor）和HLF（liver leukemia factor）等又作为重要的癌胚分子陆续被报道,为肝癌的诊断和治疗提供了新线索。不仅仅是编码基因,本课题组的前期研究中,通过比对小鼠胎肝、成肝和肝癌组织的表达谱发现,一些非编码转录本也显示出了癌胚分子特性。其中,长链非编码RNA-PVT1（lnc RNA-PVT1）和长链非编码RNA Ptn-dt（lnc Ptn-dt）在肝脏发育过程中表达逐渐降低,又在肝癌中重新激活,并在肝癌进展中发挥重要作用。前期研究结果证实,从“癌胚性”入手,利用高通量测序技术比对肝癌发生与肝发育中的共同分子事件,筛选癌胚分子是一种有效的肝癌研究策略。但是,研究过程中我们又提出了新的问题。首先,非编码RNA（non-coding RNA,nc RNA）在种属间保守性较差,通过小鼠样本研究得到的癌胚性lnc RNA极为有限,利用人类样本研究是否可以帮助我们发掘更多的具有临床价值的癌胚性长链非编码RNA（long non-coding RNA,lnc RNA）。此外,前期研究中我们仅仅关注了lnc RNA,而其他nc RNA,特别是由癌胚性lnc RNA衍生出的一些nc RNA,是否也具有癌胚特性仍不可知。为了寻找更多的在肝癌发展过程中发挥重要作用的具有癌胚特性的nc RNA,本研究中我们开展了以下两方面的工作。第一部分,通过微阵列芯片技术和生物信息学分析,我们对在人类胎肝和肝癌组织中共同高表达的lnc RNA进行了筛选。在研究过程中,我们发现lnc RNA MIR4435-2HG在胚胎发育早期的肝组织中表达水平较高,在成年肝组织中表达显著降低,而在肝癌组织中又被重新激活,具有癌胚分子的表达特征。进一步的临床样本检测结果显示,MIR4435-2HG在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织,且MIR4435-2HG高表达指示着患者较差的预后。lnc RNA的表达受多种因素调控,而m6A修饰是RNA中最常见的表观修饰元件并参与胚胎发育与肝癌进展,因此,我们猜想肝癌中MIR4435-2HG的异常激活可能与m6A修饰的动态变化有关。研究结果显示,MIR4435-2HG存在m6A修饰,同时,RNA甲基转移酶METTL3依赖m6A修饰激活肝癌中MIR4435-2HG的表达。通过构建过表达MIR4435-2HG和干扰表达MIR4435-2HG的肝癌细胞进行功能学研究,我们发现,MIR4435-2HG过表达可以显著促进肝癌细胞的体外增殖能力,和体内成瘤能力;而干扰MIR4435-2HG表达将抑制肝癌细胞的增殖。在进一步的机制研究中,RNA Pulldown实验证实,MIR4435-2HG可以与C/D盒RNA蛋白复合物（C/D box RNP）成员NOP58直接结合,并通过降低NOP58泛素化水平抑制NOP58的降解,提高核糖体RNA（r RNA）关键位点的甲基化修饰水平,增强核糖体生物学合成能力,从而促进肝癌细胞增殖。第二部分,我们探讨了由前期研究中鉴定出的癌胚分子lnc RNA-PVT1的第三个外显子环化形成的环状RNA PVT1（circ PVT1）与肝癌间的关系。我们检测了circ PVT1在胎肝、成肝组织及70对癌和癌旁组织中的表达情况,实验结果表明,类似于lnc RNA-PVT1,circ PVT1在胎肝和肝癌中的表达显著高于成肝组织,在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织,具有癌胚分子特征。同时,circ PVT1表达
