关键词：
胃癌
EZH2
p62/SQSTM1
microRNA
分子靶向治疗
摘要：
【背景与目的】胃癌具有高度侵袭性,它是全球癌症相关死亡的主要原因之一。目前胃癌的治疗采用以手术为主、放化疗为辅的综合性治疗方式。然而,由于绝大多数抗癌药物的毒副作用较大,伴随着对肿瘤发生分子基础的深入研究,分子靶向治疗已逐渐取代化疗将癌症的治疗推向全新时代。EZH2作为PRC2复合物的核心亚基之一,能够催化组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化(H3K27me3)并激活下游沉默基因。其小分子抑制剂DZNep在降低PRC2复合物表达的同时,能够阻断由EZH2介导的H3K27me3作用,进而诱导肿瘤细胞凋亡而不影响正常细胞生长。有研究发现,组蛋白甲基转移酶EZH2能够抑制细胞自噬活性。自噬既能抑制肿瘤的发生发展,又能促使肿瘤存活的特征致使其具有对肿瘤调控的两面性。自噬底物蛋白p62/SQSTM1除了参与自噬过程中受损细胞器及异常蛋白的运输外,其亦是一个关键的促癌因子。通过对自噬依赖或不依赖机制,p62/SQSTM1在肿瘤细胞中的异常积累能够促进肿瘤的形成。而最新研究报道,EZH2亦可通过mTOR依赖性途径对自噬进行表观遗传调控,并且EZH2的表达水平与SQSTM1的表达水平呈正相关。本研究发现,在EZH2调节细胞自噬过程中,p62/SQSTM1的mRNA水平和蛋白水平随之发生变化。采用生物信息学分析和报告基因实验发现,miR-139-5p通过与p62/SQSTM1的3’UTR区结合发挥转录后调控作用,进而影响胃癌细胞的恶性表型。而且,已有研究证实,EZH2与miR-139-5p之间存在表观遗传调控。因此,本实验旨在探究DZNep对胃癌细胞凋亡及自噬表型的影响;探究EZH2对p62/SQSTM1表达调控的机制;通过研究微小RNA参与EZH2介导胃癌发生发展的可能性机制,为p62/SQSTM1成为胃癌治疗新靶点提供可靠的实验依据,并为临床针对胃癌的基因靶向治疗及抗肿瘤药物的研发提供有力证据。【方法】1.通过Western Blot对细胞凋亡、细胞自噬等关键蛋白以及对EZH2、miR-139-5p和p62/SQSTM1三者之间的调控关系进行研究;2.通过qRT-PCR对细胞重组质粒干扰效果以及EZH2、miR-139-5p和p62/SQSTM1三者之间的调控关系进行研究;3.对于细胞恶性表型的研究,我们采用CCK-8细胞增殖检测或平板克隆形成实验对miR-139-5p以及p62/SQSTM调节胃癌细胞恶性增殖能力进行验证;4.通过流式细胞凋亡检测技术,研究DZNep诱导胃癌细胞凋亡强度以及p62/SQSTM1或细胞自噬对其诱导胃癌细胞凋亡敏感性的调节;5.通过细胞免疫荧光分析细胞自噬通量的变化;6.通过双荧光素酶报告基因实验、挽救实验(CCK-8、Western Blot)对miR-139-5p与p62/SQSTM1之间的调控作用进行研究;7.通过裸鼠背部荷瘤对p62/SQSTM1调节胃癌细胞恶性增殖能力进行在体验证。【结果】我们发现,DZNep在抑制EZH2蛋白表达的同时,能够显著诱导胃癌细胞凋亡,并且这种作用存在时间和剂量依赖性;另外,细胞自噬通量也会随之增加。随后,我们在mRNA水平和蛋白水平上发现,EZH2对p62/SQSTM1的表达具有正向调控作用。而且,通过体内和体外实验证实,p62/SQSTM1作为肿瘤调节因子能够促进胃癌细胞恶性增殖。针对自噬可能存在的保护性作用,我们进一步研究发现,自噬活性受抑能够抑制胃癌细胞增殖,并且,由DZNep诱导的胃癌细胞凋亡敏感性随之增强。但是,当自噬对细胞程序性死亡进程“无能为力”之时,p62/SQSTM1表达沉默能够显著增强由DZNep诱导的胃癌细胞凋亡敏感性,并由此揭示了p62/SQSTM1在分子水平上受到EZH2调控的可能性。之后,通过一系列分析证实,miR-139-5p在胃癌组织中高表达;而且,miR-139-5p是EZH2正向调控p62/SQSTM1表达的中间分子;同时,miR-139-5p能够通过直接结合p62/SQSTM1的3’UTR区抑制其表达。挽救实验进一步证明,miR-139-5p对胃癌细胞相关恶性表型的影响确实是通过抑制p62/SQSTM1的表达而实现的。【结论】在胃癌细胞中,EZH2通过抑制miR-139-5p来上调p62/SQSTM1的表达进而促进胃癌细胞的恶性增殖;同时,p62/SQSTM1基因沉默是DZNep诱导胃癌细胞凋亡的增敏因素。总结研究成果,我们发现了一条新的调节胃癌细胞恶性增殖的正反馈通路,即EZH2/miR-139-5p/p62表观遗传调控通路,这为我们对胃癌恶性表型以及胃癌防治的研究提供了重要理论依据。
